توسعه تست آویدیته الایزا با استفاده از پروتئینهای نوترکیب برای تمایز عفونت حاد از ...

1-6-بیماریزایی 22

1-7-توکسوپلاسموزیس مادرزادی……………………………………………………………………………………………….. 24

1-8-تظاهرات بالینی ……………………………………………………………………………………………………………………. 25

1-9-تشخیص توکسوپلاسموز………………………………………………………………………………………………………. 29

1-9-1- تشخیص مستقیم…………………………………………………………………………………………………………… 29

1-9-1-1-تشخیص هیستولوژی (بافت شناسی…………………………………………………………………………. 29

1-9-1-2- جداسازی توکسوپلاسما گوندی……………………………………………………………………………….. 30

1-9-1-3-تکنیک واکنش زنجیری پلیمراز (PCR1-15-2-تشخیص غیر مستقیم……………… 30

1-9-2-تشخیص غیر مستقیم ……………………………………………………………………………………………………… 31

1-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن……………………………………………………………………………………. 34

1-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم………………………………………………………….. 34

1-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت………………………………………………………………. 35

1-10-الایزا (ELISA)…………………………………………………………………………………………………………………. 35

1-10-1- الایزای مستقیم ………………………………………………………………………………………………………….. 36

1-10-2- الایزای غیر مستقیم……………………………………………………………………………………………………. 36

1-10-3- الایزای ساندویچ…………………………………………………………………………………………………………… 37

1-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم………………………………………………………………………………………… 37

1-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم…………………………………………………………………………………. 37

1-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری………………………………………………………………………………………………. 37

1-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ………………………………………………. 38

1-12-تولید پروتئین نوترکیب…………………………………………………………………………………………………….. 39

1-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی……………………………………………… 39

1-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولین

اختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت……………………………………………………………………………….. 40

1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس……………………… 42

1-16-درمان 44

1-17-پیشگیری 47

1-18- بیان مسئله و اهمیت آن………………………………………………………………………………………………….. 48

1-19- دلایل انتخاب موضوع ……………………………………………………………………………………………………… 50

1-20-اهداف و فرضیا ت ……………………………………………………………………………………………………………. 51

فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته

2-1- مروری بر تحقیقات گذشته …………………………………………………………………………………………………………….. 53

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی ……………………………………………………………….. 59

3-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی……………………………………………… 59

3-1-2- تهیه و تخلیص پروتئین های نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7) و

rGRA6(PUET-GRA6 ……………………………………………………………………………………………………………… 60

3-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده……………………………………………………………………….. 62

3-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE 62

3-2-2- تائید هویت پروتئین بیان شده با روش وسترن بلات………………………………………………….. 66

3-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده…………………………………………………………………………………………… 71

3-4- تعیین غلظت پروتئین………………………………………………………………………………………………………… 71

3-5- سیستم های الایزا(اصول کار) …………………………………………………………………………………………… 71

3-5-1- طراحی سیستم های الایزا…………………………………………………………………………………………….. 72

3-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا……………………………………………………………………………………………… 72

3-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا…………………………………………………………………………………………… 74

3-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن …

توکسوپلاسموز با روش الایزا………………………………………………………………………………………………………….. 76

3-6-1-برقراری شرایط الایزا……………………………………………………………………………………………………….. 76

3-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا ………………………………………………………………………… 76

3-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم …………………………………… 77

3-8-تعیین Cut off در روش الایزا ………………………………………………………………………………………….. 80

3-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun ………………………………… 81

3-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun ……………………………… 82

3-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG ………………………………… 82

3-12- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و

PUET-GRA6 83

3-13- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری EUROIMMUN ….. 83

3-14- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری Microgen………………… 85

3-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index ……………………………… 88

یک مطلب دیگر :

منبع پایان نامه ارشد درمورد مواد مخدر، عوامل انسانی، سلسله مراتب

3-16- کنترل کیفی ……………………………………………………………………………………………………………………. 88

3-16-1- حساسیت ……………………………………………………………………………………………………………………. 88

3-17-طراحی تحقیق ……………………………………………………………………………………………………………. 88

3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری ………………………………………………………………………………….. 89

3-18-1- تعداد نمونه …………………………………………………………………………………………………………………. 89

3-18-2- روش نمونه گیری………………………………………………………………………………………………………… 89

فصل چهارم: نتایج آزمایشات

4-1 :تهیه و تخلیص پروتئین های نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6

(PUET-GRA6 92

4-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات ……………………………………….. 93

4-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun 94

4-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای

ایرانی با کیت Euroimmun…………………………………………………………………………………………………………… . 95

4-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun 95

4-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرم ها

با کیت Euroimmun …………………………………………………………………………………………………………………… 96

4-4- برقراری شرایط ELISA Avidity با پروتئین های نوترکیب ………………………………………. 100

4-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار……………………………………………………………………………….. 103

4-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران …………………………………………………………………….. 103

4-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیت

Euroimmun با استفاده از کیت Microgen………………………………………………………………………………. 104

فصل پنجم:بحث، پیشنهادات

منابع 121

خلاصه انگلیسی ………………………………………………………………………………………… 127

ضمائم 129

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن……………………………………………………………….. 87

جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon……… 97

جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین های

GRA6 وGRA7 ……………………………………………………………………………………………………………………. 106

جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7

بر روی سرم های زنان باردار ………………………………………………………………………………………………… ….. 108

فهرست شکل ها

عنوان صفحه

شکل1-1- شكل شماتیك یك تاكی زوایت و یك برادی زوایت توكسوپلاسما گوندی ………….. 4

شکل1-2- عكس میكروسكوپ الكترونی یك تاكی زوایت، سوش VEGكه در حال

نفوذ به یك نوتروفیل صفاق موش می باشد…………………………………………………………………………………. 7

شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم

اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش………………………………………………………………………………………… 8

شکل1-4- یك كیست بافتی توكسوپلاسما كه حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد……. 9

شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط……………… 16

شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی……………………………………….. 25

شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا…………………………………………………………………………………………. 38

شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن…………………………………………………………………………………………………. 87

شکل 4-1 : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی …………………………………….. 92

شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی ……………………………………….. 93

شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7

تخلیص شده باروش وسترن بلات ……………………………………………………………………………………………….. 94

شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 ………………………………………………………………………… 101

شکل 4-5 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6………………………………………. 101

شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7………………………………………………………………………….. 102

شکل 4-7 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7……………………………………….. 102

موضوعات: بدون موضوع لینک ثابت

فرم در حال بارگذاری ...

فید نظر برای این مطلب