1-6-بیماریزایی                                                                                                  22

1-7-توکسوپلاسموزیس مادرزادی………………………………………………………………………………………………..           24

1-8-تظاهرات بالینی …………………………………………………………………………………………………………………….           25

1-9-تشخیص توکسوپلاسموز……………………………………………………………………………………………………….           29

1-9-1- تشخیص مستقیم……………………………………………………………………………………………………………             29

1-9-1-1-تشخیص هیستولوژی (بافت شناسی………………………………………………………………………….             29

1-9-1-2- جداسازی توکسوپلاسما گوندی………………………………………………………………………………..             30

1-9-1-3-تکنیک واکنش زنجیری پلیمراز (PCR1-15-2-تشخیص غیر مستقیم………………             30

1-9-2-تشخیص غیر مستقیم ………………………………………………………………………………………………………            31

1-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن…………………………………………………………………………………….             34

1-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم…………………………………………………………..             34

1-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت……………………………………………………………….             35

1-10-الایزا (ELISA)………………………………………………………………………………………………………………….             35

1-10-1- الایزای مستقیم …………………………………………………………………………………………………………..             36

1-10-2- الایزای غیر مستقیم…………………………………………………………………………………………………….             36

1-10-3- الایزای ساندویچ……………………………………………………………………………………………………………             37

1-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم…………………………………………………………………………………………             37

1-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم………………………………………………………………………………….             37

1-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری……………………………………………………………………………………………….             37

1-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ……………………………………………….             38

1-12-تولید پروتئین نوترکیب……………………………………………………………………………………………………..             39

1-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی………………………………………………             39

 

1-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولین

اختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت………………………………………………………………………………..             40

1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس………………………             42

1-16-درمان                                                                                                      44

1-17-پیشگیری                                                                                                  47

1-18- بیان مسئله و اهمیت آن…………………………………………………………………………………………………..             48

1-19- دلایل انتخاب موضوع ………………………………………………………………………………………………………             50

1-20-اهداف و فرضیا ت …………………………………………………………………………………………………………….             51

فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته                             

2-1- مروری بر تحقیقات گذشته ……………………………………………………………………………………………………………..  53

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی ………………………………………………………………..             59

3-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی………………………………………………             59

3-1-2- تهیه و تخلیص پروتئین های  نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7) و

rGRA6(PUET-GRA6 ………………………………………………………………………………………………………………             60

3-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده………………………………………………………………………..             62

3-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE             62

3-2-2- تائید هویت پروتئین بیان شده با روش وسترن بلات…………………………………………………..            66

3-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده……………………………………………………………………………………………             71

3-4- تعیین غلظت پروتئین…………………………………………………………………………………………………………             71

3-5- سیستم های الایزا(اصول کار) ……………………………………………………………………………………………             71

3-5-1- طراحی سیستم های الایزا……………………………………………………………………………………………..             72

3-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا………………………………………………………………………………………………             72

3-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا……………………………………………………………………………………………             74

3-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن …

توکسوپلاسموز با روش الایزا…………………………………………………………………………………………………………..             76

3-6-1-برقراری شرایط الایزا………………………………………………………………………………………………………..             76

3-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا      …………………………………………………………………………             76

3-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم     ……………………………………             77

3-8-تعیین Cut off  در روش الایزا …………………………………………………………………………………………..             80

3-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun …………………………………             81

3-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun ………………………………             82

3-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG …………………………………             82

3-12- اندازه گیری IgG Avidity Index  با استفاده از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و

PUET-GRA6                                                                                                   83

3-13- اندازه گیری IgG Avidity Index  با استفاده از کیت تجاری EUROIMMUN  …..             83

3-14- اندازه گیری IgG Avidity Index  با استفاده از کیت تجاری Microgen…………………             85

3-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index ………………………………             88

یک مطلب دیگر :

3-16- کنترل کیفی …………………………………………………………………………………………………………………….             88

3-16-1- حساسیت …………………………………………………………………………………………………………………….             88

3-17-طراحی تحقیق     …………………………………………………………………………………………………………….             88

3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری  …………………………………………………………………………………..             89

3-18-1- تعداد نمونه ………………………………………………………………………………………………………………….             89

3-18-2- روش نمونه گیری…………………………………………………………………………………………………………             89

فصل چهارم: نتایج آزمایشات

4-1 :تهیه و تخلیص پروتئین های  نو تركیب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6

(PUET-GRA6                                                                                                   92

4-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات ………………………………………..             93

4-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun                 94

4-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرمهای

ایرانی با کیت Euroimmun…………………………………………………………………………………………………………… .           95

4-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun        95

4-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA  مخصوص توکسوپلاسما سرم ها

با کیت Euroimmun  ……………………………………………………………………………………………………………………            96

4-4- برقراری شرایط ELISA  Avidity با پروتئین های نوترکیب  ……………………………………….           100

4-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA  با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار………………………………………………………………………………..           103

4-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA  با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایز

عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران  ……………………………………………………………………..           103

4-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیت

Euroimmun با استفاده از کیت Microgen……………………………………………………………………………….           104

فصل پنجم:بحث، پیشنهادات

منابع                                                                                                                                       121

خلاصه انگلیسی   …………………………………………………………………………………………            127

ضمائم                                                                                                                                      129

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                   صفحه

جدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن………………………………………………………………..            87

جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon………            97

جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین های

GRA6 وGRA7     …………………………………………………………………………………………………………………….           106

جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7

بر روی سرم های زنان باردار ………………………………………………………………………………………………… ….. 108

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                                   صفحه

شکل1-1- شكل شماتیك یك تاكی زوایت و یك برادی زوایت توكسوپلاسما گوندی …………..              4

شکل1-2- عكس میكروسكوپ الكترونی یك تاكی زوایت، سوش  VEGكه در حال

نفوذ به یك نوتروفیل صفاق موش می باشد………………………………………………………………………………….              7

شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم

اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش…………………………………………………………………………………………              8

شکل1-4- یك كیست بافتی توكسوپلاسما كه حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد…….              9

شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط………………             16

شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی………………………………………..            25

شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا………………………………………………………………………………………….             38

شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن………………………………………………………………………………………………….             87

شکل 4-1  : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی ……………………………………..             92

شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی ………………………………………..             93

شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7

تخلیص شده باروش وسترن بلات ………………………………………………………………………………………………..             94

شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 …………………………………………………………………………           101

شکل 4-5 :  تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6……………………………………….           101

شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما

در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7…………………………………………………………………………..           102

شکل 4-7 :  تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن

عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7………………………………………..           102