دانشگاه شیراز
دانشکده کشاورزی
پایاننامه کارشناسی ارشد در رشته اصلاح نباتات
بررسی الگوی بیان ژن رمزکننده H+– ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش فلزات سنگین
استاد راهنما
دکتر عباس عالمزاده
اساتید مشاور
دکتر هومن راضی
دکتر حسن پاکنیت
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
چکیده
به منظور بررسی الگوی بیان ژن H+– ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش فلزات سنگین بذور این گیاه پس از جمع آوری از منطقه پل فسا واقع در جنوب شهر شیراز در گلخانه بخش زراعت و اصلاح نباتات داشکده کشاورزی دانشگاه شیراز کشت شدند. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. پس از گذشت دو ماه تیمارهای سرب، جیوه، نقره و کلرید سدیم هر کدام در دو سطح اعمال شدند. سپس در چهار بازه زمانی 0، 6، 48 و 72 ساعت پس از تنش نمونه برداری انجام و سریعا نمونهها در نیتروژن مایع قرار داده و سپس تا زمان انجام آزمایش در فریزر 80- نگهداری شدند. نتایج نشان داد که فلزات سنگین مختلف تأثیر متفاوتی روی رشد گیاه و میزان بیان ژن Alha1 دارند. بررسی بیان ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی نشان داد که در سطح µM50 بیشترین میزان بیان ژن مربوط به نقره زمان 72 ساعت و کمترین آن مربوط به سرب در زمان 6 ساعت پس از اعمال تنش بود. همچنین در سطح µM 100 بیشترین میزان بیان ژن مربوط به تیمار نقره در زمان 72 ساعت و کمترین آن مربوط به سرب در زمان 72 ساعت پس از اعمال تنش بود. همچنین بیان ژن تحت تأثیر کلرید سدیم در دو غلظت mM 200 و mM 400 در همه زمانها افزایش یافت. همچنین مشاهده شد که مقدار فلزات در گیاه بدون تأثیر بر رشد گیاه افزایش یافت. این نتایج نشان میدهد که این گیاه ممکن است فلزات سنگین را بخوبی در خود نگه داشته و در این میان ژن Alha1 نقش مهمی بازی می‌کند. به طور کلی میتوان گفت که میزان بیان ژن در گیاه تحت تأثیر نوع فلز، غلظت فلز، اندام مورد نظر، زمان تنش و شرایط تنش تغییر می‌کند.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول
مقدمه. 1
1-1- تنش…. 1
1-2- شوری خاک… 1
1-3- اثرات شوری بر گیاهان.. 2
1-4- تنش فلزات سنگین.. 2
1-4-1- سرب.. 4
1-4- 2- جیوه 4
1-4- 3- نقره 5
1-5- ویژگی‌های پروتئین‌های H+-ATPaseغشای پلاسمایی.. 6
1-6- ویژگی‌های گیاه Aeluropus littoralis. 7
1-7- اهداف پژوهش…. 9
فصل دوم
مروری بر پژوهشهای پیشین.. 10
2-1- انتقال پیام در پاسخ به تنش فلزات سنگین.. 10
2-1- 1- سیستم کلسیم/کالمادولین.. 10
2-1-2- نقش هورمونها 11
2-1-3- تنش اکسیداتیو. 11
2-1-4- مسیر MAPK.. 12
2-2- انواع پمپ‌های ATPase. 12
2-3- H+-ATPase و تحمل تنش شوری.. 14
برای دیدن جزییات بیشتر و دانلود پایان نامه اینجا کلیک کنید
2-4- H+-ATPase و تحمل تنش فلزات سنگین.. 15
فصل سوم
مواد و روشها 17
3-1- جمع آوری نمونه‌ها‌ی گیاهی.. 17
3-2- کاشت بذرها 17
3-3- اعمال تیمار. 18
3-4- محلول هوگلند. 19
3-5- اندازه‌گیری میزان عناصر. 20
3-6- طراحی آغازگر. 21
3-7- استخراج دی‌ان‌ا از نمونه‌ی گیاهی با استفاده از روش CTAB تغییریافته. 22
3-7-1-تهیه‌ی محلول استخراج. 22
3-7-2- روش کار 22
3-7-3- محلول شستشوی شماره 1. 24
3-7-4- محلول شستشوی شماره 2. 24
3-8- استخراج آر‌ان‌ا 24
3-8-1- روش کار 24
3-9- سنتز رشته اول cDNA.. 26
3-10- واكنش RT-PCRبرای ژنهای AlHA1و مرجع.. 26
3-11- تهیه ژل آگارز. 27
3-12- بافر( X50) TAE.. 28
3-12-1- محلول Tris 28
3-12-2- محلول اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 28
3-13- همسانه‌سازی قطعه مورد نظر در پلاسمید. 29
3-13-1- اتصال قطعه مورد نظر به درون ناقل پلاسمیدی.. 29
3-13-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری E. coli سویه DH5α. 30
3-13-3- انتخاب همسانه‌ها 31
3-13-4- کشت شبانه‌ی کلنی‌های مثبت.. 32
3-13-5- استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری به روش لیز کردن آلکالاینی.. 32
یک مطلب دیگر :
3-13-6- هضم آنزیمی پلاسمیدهای نوترکیب.. 35
3-14- آنالیزهای آماری.. 36
فصل چهارم
نتایج و بحث… 37
4-1- آنالیز صفات مورفولوژیک… 37
4-1-1- وزن ریشه. 37
4-1-2-وزن ساقه. 39
4-1-3- وزن کل گیاه 40
4-1-4-طول ریشه. 41
4-1-5- طول ساقه. 41
4-1-6-طول کل گیاه 42
4-2- اندازه‌گیری عناصر در گیاه. 43
4-2-1- جیوه 44
4-2-2- سرب.. 44
4-2-3- نقره 45
4-3- کمیت و کیفیت دی‌ان‌ا استخراج شده. 46
4-4- استخراج RNA از برگ گیاه A. littoralis. 46
4-5 – واکنش زنجیره‌ای پلیمراز PCR 47
4-6- بررسی بیان ژن Alha1 تحت تنش فلزات سنگین و شوری به روش نیمه کمی.. 48
4-6-1- بررسی اثر سطوح مختلف سرب در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1 49
4-6-2- بررسی اثر سطوح مختلف نقره در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1 50
4-6-3- بررسی اثر سطوح مختلف کلرید سدیم در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1 52
4-6-4- بررسی اثر سطوح مختلف جیوه در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1 53
4-7- همسانه‌سازی محصول پیسیآر. 56
4-8 – نتیجه گیری.. 57
4-9- پیشنهادات.. 58
مقدمه
1-1- تنش
در محیطهای طبیعی و شرایط زراعی، گیاهان به دفعات در معرض تنشهای محیطی قرار میگیرند. تنش معمولاً به عنوان یک عامل خارجی که باعث تأثیر منفی بر زندگی گیاه میشود تعریف میشود. مفهوم واژه تنش همواره با تحمل تنش همراه است که قابلیت گیاه در رو به رو شدن با شرایط نامساعد محیطی است. تطابق و سازگاری به تنشهای محیطی ناشی از تغییرات در سطوح مختلف اندامهای موجود زنده از سطح آناتومیک و مورفولوژیک تا سطوح سلولی، بیوشیمیایی و مولکولی رخ میدهد. واکنشهای سلولی به تنش شامل تغییر در چرخه سلولی و تقسیم سلولی، تغییر در سیستم غشاهای داخلی و واکوئلی سلول و تغییر در ساختار دیواره سلولی است که در تمام این پاسخها شاهد تغییر الگوی بیان ژن یا ژنهایی هستیم است که محصول آنها در تنش مؤثر هستند (Taiz and Zeiger, 1991).
1 -2 – شوری خاک
سابقه شوری خاک به اندازه تمدن بشری است و احتمالاً دلیل انقراض تمدن باستانی سومر، شور شدن خاک بوده است (Jacobsen and Adams, 1958). امروزه نیز شوری یکی از تنشهای غیر زنده مهم به شمار میرود که اثرات زیانباری بر عملکرد و کیفیت محصول دارد (Boyer, 1982). در آسیا بیشترین مساحت اراضی شور پس از کشورهای آسیای میانه، هندوستان و پاکستان در ایران قرار دارد. از کل مساحت ایران که 165 میلیون هکتار است، حدود 44 میلیون هکتار آن تحت تاثیر شوری بوده که نزدیک به 30 درصد دشتها و متجاوز از 50 درصد اراضی تحت کشت آبی کشور را تشکیل میدهد (Pillaya et al., 2005). منبع اصلی که خاک را شور می‌کند نمکهای محلولی است که در منابع آب زیر زمینی وجود دارد. برآورد شده است که تقریباً 15 درصد از اراضی ایران تحت تأثیر نمک با درجات مختلف قرار دارد (ملکوتی و همکاران، 1381). شوری خاک و آبهای کم کیفیت از جمله مشکلات جدی در تولید محصولات کشاورزی میباشند. ایران از جمله کشورهایی است که با کمبود آب آبیاری و مشکل خاک روبرو است. مشکل شوری به خاطر زیاد بودن تبخیر از سطح خاک، بارندگی کم، پستی و بلندی زمینها، آبیاری با آب دارای کیفیت نامناسب و سنگهای نمکی است. عوامل فوق باعث به وجود آمدن شورهزارهای زیادی شده است. در سالهای اخیر روند شور شدن خاکها افزایش یافته و هکتارها زمین قابل کشت به علت تجمع بیش از حد نمک غیر قابل کشت شدهاند (Pillaya et al., 2005).
1-3- اثرات شوری بر گیاهان
شوری برای رشد گیاه یک عامل محدود کننده است بدان سبب که باعث ایجاد محدودیتهای تغذیهای از طریق کاهش جذب فسفر، پتاسیم، نیترات و کلسیم و افزایش غلظت یونی درون سلولی و تنش اسمزی میشود (Guo et al., 2001). در اثر شوری، پتانسیل آب محیط می‌تواند از پتانسیل آب گیاه منفی‌تر شود و همین امر جذب آب توسط گیاه را با مشکل روبه‌رو می‌کند (کافی و مهدوی دامغانی، 1379). در شرایط وقوع شوری، یونهایی مثل Na+ و Cl–، به داخل لایههای هیدراسیونی پروتئینها نفوذ کرده، سبب اختلال در کار پروتئینها میشوند. مسمومیت یونی، تنش اسمزی و کمبود مواد مغذی که در شرایط وقوع شوری رخ میدهد، سبب بهم خوردن توازن یونی و در پی آن تنش اکسیداتیو میشوند (Guo et al., 2001). کاهش رشد در گیاهان تحت شرایط تنش شوری می‌تواند به دلیل کاهش ذخایر انرژی گیاه باشد که این متأثر از کاهش و اختلال فعالیتهای زیستی و متابولیسمی گیاه میباشد (Kerepesi and Galiba, 2000).
|
[پنجشنبه 1399-08-08] [ 10:15:00 ق.ظ ]
|
