1-13-4 تاریخچه فیلوژنی سرده Viola…………………………………..

1- 14 اهداف……………………………………………………………….. 39

فصل دوم: مواد و روش ها

2-1 مطالعات تشریحی……………………………………………………. 41

2-1-1 روش تهیه محلول های رنگ آمیزی……………………………….. 42

2-2 بررسی مورفومتری و آنالیز عددی…………………………………… 44

2-2-1 نمونه برداری………………………………………………………… 44

2-2-2 اندازه گیری و آنالیز………………………………………………….. 45

2-3 مطالعه ی فیلوژنی مولکولی در گونه های Viola…………………..

2-3-1 استخراج DNA ژنومی از گیاه با استفاده از روش CTAB………..

2-3-1-1 روش تهیه بافر CTAB……………………………………………

2- 3 – 1 -2  تعیین غلظت و خلوص DNA……………………………….

2- 4  تکثیر قطعات DNA مورد نظر……………………………………….. 52

2- 4- 1 آغازگر ها………………………………………………………….. 52

2- 4- 2 دستورالعمل واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)………………… 52

2-4-3 برنامه واکنش PCR برای تکثیر قطعات  DNA مورد مطالعه……… 53

2-4-4 الكتروفورز ژل آگارز………………………………………………….. 53

2-4-5 تخلیص PCR………………………………………………………….

2-4-5-1 تخلیص محصول PCR……………………………………………..

2-4-5-2 تخلیص محصول PCR  از ژل……………………………………… 55

2- 4-6  تعیین توالی قطعات تکثیر یافته و آنالیز آنها……………………. 56

2-4-7 آنالیز فیلوژنتیکی……………………………………………………. 57

2-4-7-2 روش بیشینه صرفه جویی………………………………………. 58

2- 4- 7-3  روش بیشینه احتمال………………………………………….. 58

2- 4-7- 5 مقایسه دو روش آنالیزی MP  و ML…………………………..

2- 4-7- 6 نحوه ی ترکیب دو مجموعه اطلاعاتی trnL-F و ITS………..

 

فصل سوم: نتایج

3-1 کلید شناسایی گونه های Viola در شمال ایران…………………. 62

3-2 شرح گونه های بخشه Viola……………………………………….

3-3 مطالعات تشریحی…………………………………………………… 82

3-4 آنالیز عددی……………………………………………………………. 98

3-4-1 زیربخشه Viola……………………………………………………..

3-4-2 زیربخشه Rostratae………………………………………………

3-5 مطالعات ملکولی…………………………………………………….. 103

3-5-2 تعیین توالی قطعه تکثیر یافته…………………………………….. 105

3-5-3 آنالیز فیلوژنتیکی توالی ITS……………………………………….

3-5-3-1  آنالیزماکسیمم پارسیمونی داده های مولکولی nrDNA ITS……….

3-5-3-2 آنالیزماکسیمم پارسیمونی داده های trnL-F cpDNA……..

3-5-3-3  آنالیز Maximum Liklihood داده های nrDNA ITS…………

3-5-3-4 آنالیز Maximum Liklihood داده های trnL-F cpDNA………

3-5-3-5 آنالیزماکسیمم پارسیمونی داده های ترکیبی nrDNA ITS  وcpDNA trnL-F

3-5-3-6 آنالیز Maximum Liklihood داده های ترکیبی nrDNA ITS  وcpDNA trnL-F

فصل چهارم: بحث

4-1 مطالعات تاکسونومیکی…………………………………………. 124

4-2 مطالعات آناتومی…………………………………………………. 127

4-3 تاکسونومی عددی……………………………………………….. 129

4-4 مطالعات ملکولی…………………………………………………. 130

4-5 پیشنهادات………………………………………………………… 134

فصل پنجم: منابع

منابع…………………………………………………………………….. 136

چکیده:

در این مطالعه، بررسی بیوسیستماتیکی بخشه Viola از سرده Viola در شمال ایران از جنبه های مرفولوژیکی، آناتومیکی و ملکولی انجام شد. آنالیز عددی برای تاکسونهای جمع آوری شده از ایران متعلق به دو زیربخشه Viola و Rostratae به صورت جداگانه انجام گرفت و بر اساس نتایج حاصل از این آنالیز، گونه های هر کدام از زیربخشه های Viola و Rostratae از یکدیگر متمایز شدند. به منظور انجام مطالعات آناتومیکی، بخش های ریشه، ساقه رونده، برگ، دمبرگ و دمگل مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که صفات مورد بررسی در تمایز زیربخشه ها و گونه ها  مفید هستند. بر این اساس دو گونه V. alba ssp. alba و V. sintenisii، در برشهای ریشه در وجود یا عدم وجود ناحیه مغز و تعداد لایه های پارانشیمی زیر آوند چوب از یکدیگر متمایز گردیدند. دو گونه نزدیک V. caspia و V. reichenbachiana نیز در برش های ریشه، در وجود یا عدم وجود مغز و تراکم کریستالی از یکدیگر قابل تمایز بودند. در بررسی مولکولی، از دو نشانگر، شامل nrDNA ITS و cpDNA trnL-F برای تعیین حدود گونه ها استفاده شد. بر این اساس، گونه های این بخشه به خوبی از یکدیگر متمایز شدند. به منظور بازسازی روابط فیلوژنی بخشه Viola و بررسی میزان خویشاوندی این بخشه با سایر بخشه های سرده Viola، داده های مولکولی با استفاده از روش بیشینه صرفه جویی تعبیه شده در نرم افزار PAUP* 4.b10 و روش بیشینه احتمال در نرم افزار TreeFinder (Version Of March 2011) آنالیز شدند. درخت مطلق مرکزی با بیشترین پارسیمونی برای داده های ترکیبی ITS و trnL-F، یک کلاد با ارزش حمایتی 100% را برای بخشه Viola بادو زیر بخشه Viola و  Rostratae نشان می دهد. نتایج حاصل از این مطالعه، حضور 6 گونه و 3 زیر گونه را تایید کرده است. نتایـج به دست آمده نشان داد که V. alba ssp. alba و V. sintenisii به صورت سیمپاتریک در شمال ایران پراکنش دارد.

مقدمه:

1-1- تاریخچه مطالعات سیستماتیکی سرده Viola 

 

یک مطلب دیگر :

سرده .Viola L. با دارا بودن 600-525 گونه همـی کریپتوفیت[1]، کامـوفیت[2] و فانـروفیت[3] بزرگتـرین سـرده خانـواده Violaceae اسـت Clausen, 1964; Ballard, 1996)). ایـن سـرده در سـال 1753 توسـط لینــه[4] معـرفی شد و نمـونه تیپ  این سـرده، V. odorata است که در سال 1982 نمونه لکتوتیپ آن توسط Haesler جمع آوری و گزارش شد (Marcussen, 1998).

این سرده در سال 1823 توسط گیاهشناس سوئیسی De Candolle به بخشه ها و زیر بخشه های مختلف طبقه بندی شد (Chatterjee & Sharma, 1987). در سده گذشته، مونوگرافر آلمانی، Becker، اولین  تاکسونومیستی بود که این سرده را در سطح جهان بررسی کرد و تعداد بسیار زیادی گونه جدیـد و تقسیم بندیهای تاکسونومیکـی جدیدی معرفی کرد (Becker, 1916, 1917a, 1917b, 1918, 1922, 1923a, 1923b, 1923c, 1923d, 1924, 1925a). مطالعات وی در ایـن زمینـه (1925b)، اولیـن ارزیابـی جامـع سرده Viola را شامـل شناسـایی 14 بخشه و تقـریباً دو برابر گروه های زیر بخشـه ای در جهـان، بوجـود آورد، بزرگتـرین بخشـه آن Nomimium بود که بعدها به نام بخشـه Viola تغییـر پیـدا کرد. سپس Clausen (1927, 1929, 1964) بازبینی های تاکسونومیکی عمده ای بر طبقه بندی Becker انجام داد که اغلب آنها توسط متخصصان بعدی پذیرفته شد، در حالیکه قسمتی هنوز مبهم باقی مانده است. متخصصان دیگر تغییرات دیگری اعمال کردند که عمدتاً شامل نامگذاری های اولیه بود (Bamford & Gershoy, 1930; Gershoy, 1934; Yuzepchuk & Klokov, 1974). Clausen گروه های بدون ساقه اصلی با عدد کروموزومی پایه x=12 یا مشتقات آنیوپلوئیدی را در بخشه Plagiostigma قرار داد و گروه های با عدد پایه کروموزومی x=10 را در بخشه Nomimium (بخشه نامعتبر Rostellatae در طبقه بندی خودش) قرار داد که اکنون به میزان زیادی کاهش پیدا کرده است. وی همچنین گروه هایی که به طور برجسته دارای ساقه اصلی و گلهای زرد بودند را از سری ها و زیربخشه ها به بخشه Chamaemelanium ارتقاء داد و بخشه Nuttallianae را به تعدادی زیر بخشه تقسیم کرد. اگرچه برخی متخصصان بخشه Dischidium در طبقه بندی Becker را حفظ کردند و زیر بخشه Orbiculares را در بخشه Nomimium ابقا کردند، Clausen بخشه Dischidium و Orbiculares را ادغام کرد و آنها را در بخشه Chamaemelanium، زیر بخشه Beflorae که به صورت نامعتبر چاپ شده بود، قرار داد. Clausen و دیگر متخصصان عقاید متفاوتی درباره محدوده و مرتبه گروه های Adnatae، Diffusae، Langsdorffianae، Stolonosae و Vaginate ابراز کرده اند (Ballard et al., 1999).

تصویری از خلاصه طبقه بندی Becker و تغییرات عمده اعمال شده توسط محققین بعدی در شکـل 1-1-1 نشان داده شده است.

2-1- موقعیت سیستماتیکی تیره Violaceae 

تیره Violaceae Batsch. با 23 جنس و نزدیک به 900-825 گونه عموماً در نواحی گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان پراکنش دارد (Munzinger & Ballard, 2003; Melchior, 1925; Valentine, 1962; Watson & Dallwitz, 1992-97; Kruse, 1994). این تیره به مدت طولانی به عنوان تیره اصلی[1] راسته Violales شناخته می شد (Cronquist, 1981; Takhtajan, 1997)، ولی بر اساس مطالعات ملکولی در راسته Malpighiales قرار گرفته است (APG II, 2003; APGIII, 2009). دراین راستـه، تیـره Violaceae و 4 تیـره دیگـر (Achariaceae, Lacistemataceae, Passifloraceae & Salicaceae) یک کلاد را تشکیل می دهند (Davis et al., 2005; Tokuoka & Tobe, 2006) و Violaceae به عنوان گروه خواهری با Passifloraceae در نظر گرفته می شود (Soltis et al., 2007; Tokuoka & Tobe, 2006).

طبقه بندی تیره Violaceae توسط چندین گیاه شناس بررسی شده است (Melchior, 1925; Hekking, 1988; Munzinger & Ballard, 2003). با توجه به اغلب سیستم های طبقه بندی اخیر، این تیره به 3 زیر تیره تقسیم می شود: Leonioideae و Fusispermoideae از آمریکای جنوبی، که هر دو مونوژنریک و به طور مشخص ابتدایی هستند (Hodges et al., 1995; Hekking, 1988) و Violoideae که اشتقاق بیشتری دارد و بقیه سرده را شامل می شود. این طبقه بندی بر اساس پیچش گل در غنچه[2]، میوه، نوع بذر و میزان اتصال سطح پشتی بساک ها بوده است (Hekking, 1988; Munzinger & Ballard, 2003). زیر تیره Violoideae بر اساس دو صفت جام گل منظم یا نامنظم و حضور یا عدم حضور شهدگاه[3] به 2 طایفه Violeae و Rinoreae تقسیم می شود (Hekking, 1988; Munzinger & Ballard, 2003)، که سرده Viola متعلق به طایفه Violeae می باشد.

3-1- موقعیت سیستماتیکی سرده Viola

سرده Viola  بر اساس سیستم APG III طبق سلسله مراتب طبقه بندی زیر قرار می گیرد (APG III, 2009)

گونه های Viola در ایران بر اساس فلور ایران، در دو بخشه قرار می گیرند: بخشه Viola با 14 گونه و بخشه Melanium  با 5 گونه (خاتم ساز، 1991). این تقسیم بندی در فلورا ایرانیکا به این صورت است:

بخشه Viola با 9 گونه، بخشه Melanium با 4 گونه و بخشه Sclerosium با 2 گونه.

4-1- شرح ریخت شناسی تیره Violaceae

گیـاهانی علفی، درختچـه ای یا درختـی؛ کرک ها اغلب ساده؛ برگ ها متنـاوب یا متقابل، گاهی تشکـیل رزت انتهایی می دهند؛ ساده یا گاهی لوبدار، با حاشیه کامل یا اره ای و رگبندی شانه ای یا پنجه ای؛ دارای گوشوارک. گل آذین اغلب کاهش یافته به صورت یک گل منفرد، معمولاً محوری؛ گل ها اغلب دوجنسی؛ کاسبرگ ها 5 عدد، جدا از هم، گلبرگ ها 5 عدد، جدا از هم، با آرایش متراکب [1]یا حلقوی[2]، گلبرگ پایینی گاهی مهمیز دار. پرچم ها معمولاً 5 عدد، کنار یکدیگر به صورت یک حلقه به دور مادگی قرار گرفته اند، میله بسیار کوتاه، جدا از هم تا کمی پیوسته، دو بساک پشتی یا همه بساک ها با شهدگاه مهمیزی یا غده ای شکل، اغلب به یک زایده رأسی سه گوش یا غشایی متصل شده؛ دانه های گرده اغلب Tricolporate؛ برچه ها معمولاً 3 عدد، متصل؛ تخمدان فوقانی، با تمکن جانبی؛ خامه معمولاً خمیده یا نوک دار، کلاله معمولاً پهن شده، گاهی لوبدار. تخمک ها یک عدد یا بیشتر در هر تمکن؛ میوه معمولاً کپسول چند خانه ای؛ بذر ها معمولاً دارای زایده آریل.

5-1- شرح ریخت شناسی سردهViola

ریخت شناسی گل

سرده Viola بر اساس ریخت شناسی گل به دو دسته تقسیم می شود (Tutin et al., 1968): بخشه Melanium که Pansies نامیده می شوند و سایر بخشه ها که با نام عمومی Violets شناخته می شوند. وجه تمایز دو گروه نحوه قرارگیری گلبرگ های کناری است که در Violets به سمت پایین و در Pansies به سمت بالا است. ویژگی های متمایز کننده دیگر عبارتند از: (i) پراکنش بیوجغرافیایی: Pansies تنها در اروپا و غرب آسیا پراکنش دارد، درحالیکه Violets همه جا زی[1] هستند (Clausen, 1929). (ii) وجود چند شکلی[2] دانه گرده: بررسی 28 گونه اروپایی Viola نشان می دهد که 81% گونه های Pansies این چند شکلی را نشان می دهند در صورتی که این رقم برای Violets 42% است (Dajoz, 1999)؛ (iii) دیگر ویژگی های ریخت شناسی گل مانند طول جام گل و طول مهمیز؛ همچنین اکولوژی گرده افشانی در بین دو گروه به میزان زیادی متفاوت است (Beattie, 1971, 1974; Herrera, 1993; Ballard, 1996). Pansies تنها گل های برون زاد آور (Chasmogamous) تولید می کننـد (Knuth, 1908; Herrera, 1993)، در حالیکه Violets هر دو نوع گل های باز و جاذب حشرات (Chasmogamous) و گل های شدیداً کاهش یافته، بسته و خود گرده افشان (Cleistogamous) تولید می کنند (Beattie, 1969; Grime et al., 1986).

فرم رویشی: در سرده Viola، فرم رویشی به میزان قابل توجهی در بین گونه ها متفاوت است. ساختار پایه غالب در این سرده، ریزوم با برگ های رزت انتهایی (در چند ردیف)، چند ساله و ساقه گل دهنده جانبی (با برگ هایی در دو ردیف)، یک ساله است. این ساختار پایه برای مثال در V. riviniana و V. rupestris، به شکل های مختلف تغییر می یابد. در برخی گونه ها، برگ های رزت وجود نداشته و تنها ساقه گل دهنده خارج شده از ریزوم دیده می شود (V. elatior, V. canina). در برخی دیگر، ساقه هوایی به صورت ساقه رونده[3] تغییر یافته (V. palustris, V. odorata) و یا اصلاًً وجود ندارد (V. hirta, V. somchetica). در بخشه Melanium سیستم ساقه ای اصلی به میزان زیادی تغییر یافته و به آسانی قابل شناسایی نیست. گونه های درختی و درختچه ای در هاوایی دیده می شود (V. tracheliifolia, V. waialenalenae).  به گونه هایی که گل های آن در ساقه های هوایی قرار دارد، ساقه دار[4]  و به آن دسته که گل ها از محل خروج  برگ های رزت ایجاد می شوند، بدون ساقه[5] می گویند.

برگ: برگ ها ساده، رزت و یا ساقه ای با آرایش متناوب؛ معمولاً قلبی شکل، کلیوی شکل تا سه گوش، گاهی کشیده یا تخم مرغی و یا  قاشقی؛ حاشیه کامل، دندانه دار یا اره ای؛ دمبرگ دار.