دانشگاه شیراز

 

دانشکده کشاورزی

 

پایان­نامه کارشناسی ­ارشد در رشته اصلاح نباتات

 

 بررسی الگوی بیان ژن رمزکننده H⁺– ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش ­فلزات سنگین

 

 استاد راهنما

 

دکتر عباس عالم‏زاده

 

اساتید مشاور

 

دکتر هومن راضی

 

 دکتر حسن پاک‏نیت

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده

به منظور بررسی الگوی بیان ژن H⁺– ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش ­فلزات سنگین بذور این گیاه پس از جمع آوری از منطقه پل فسا واقع در جنوب شهر شیراز در گلخانه بخش زراعت و اصلاح نباتات داشکده کشاورزی دانشگاه شیراز کشت شدند. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. پس از گذشت دو ماه تیمار‏های سرب، جیوه، نقره و کلرید سدیم هر کدام در دو سطح اعمال شدند. سپس در چهار بازه زمانی 0، 6، 48 و 72 ساعت پس از تنش نمونه برداری انجام و سریعا نمونه‏ها در نیتروژن مایع قرار داده و سپس تا زمان انجام آزمایش در فریزر 80- نگهداری شدند. نتایج نشان داد که فلزات سنگین مختلف تأثیر متفاوتی روی رشد گیاه و میزان بیان ژن Alha1 دارند. بررسی بیان ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی نشان داد که در سطح µM50 بیشترین میزان بیان ژن مربوط به نقره زمان 72 ساعت و کمترین آن مربوط به سرب در زمان 6 ساعت پس از اعمال تنش بود. همچنین در سطح µM 100 بیشترین میزان بیان ژن مربوط به تیمار نقره در زمان 72 ساعت و کمترین آن مربوط به سرب در زمان 72 ساعت پس از اعمال تنش بود. همچنین بیان ژن تحت تأثیر کلرید سدیم در دو غلظت mM 200 و mM 400 در همه زمان‏ها افزایش یافت. همچنین مشاهده شد که مقدار فلزات در گیاه بدون تأثیر بر رشد گیاه افزایش یافت. این نتایج نشان می‏دهد که این گیاه ممکن است فلزات سنگین را بخوبی در خود نگه داشته و در این میان ژن Alha1 نقش مهمی بازی می‏کند. به طور کلی می‏توان گفت که میزان بیان ژن در گیاه تحت تأثیر نوع فلز، غلظت فلز، اندام مورد نظر، زمان تنش و شرایط تنش تغییر می‏کند.

فهرست مطالب

عنوان                 صفحه

فصل اول

مقدمه. 1

1-1- تنش…. 1

1-2- شوری خاک… 1

1-3- اثرات شوری بر گیاهان.. 2

1-4- تنش فلزات سنگین.. 2

1-4-1- سرب.. 4

1-4- 2- جیوه 4

1-4- 3- نقره 5

1-5- ویژگی‏های پروتئین‌های  H⁺-ATPaseغشای پلاسمایی.. 6

1-6- ویژگی‌های گیاه Aeluropus littoralis. 7

1-7- اهداف پژوهش…. 9

فصل دوم

مروری بر پژوهشهای پیشین.. 10

2-1- انتقال پیام در پاسخ به تنش فلزات سنگین.. 10

2-1- 1- سیستم کلسیم/کالمادولین.. 10

2-1-2- نقش هورمون‏ها 11

2-1-3- تنش اکسیداتیو. 11

2-1-4- مسیر MAPK.. 12

2-2- انواع پمپ‌های  ATPase. 12

2-3- H⁺-ATPase و تحمل تنش شوری.. 14

برای دیدن جزییات بیشتر و دانلود پایان نامه اینجا کلیک کنید

2-4- H⁺-ATPase و تحمل تنش فلزات سنگین.. 15

فصل سوم

مواد و روش‏ها 17

3-1- جمع آوری نمونه‌ها‌ی گیاهی.. 17

3-2- کاشت بذرها 17

3-3- اعمال تیمار. 18

3-4- محلول هوگلند. 19

3-5- اندازه‏گیری میزان عناصر. 20

3-6- طراحی آغازگر. 21

3-7- استخراج دی‏ان‏ا از نمونه‌ی‌ گیاهی با استفاده از روش CTAB تغییریافته‌. 22

3-7-1-تهیه‌ی محلول استخراج. 22

3-7-2- روش کار 22

3-7-3- محلول شستشوی شماره 1. 24

3-7-4- محلول شستشوی شماره 2. 24

3-8- استخراج آر‌ان‌ا 24

3-8-1- روش کار 24

3-9- سنتز رشته اول cDNA.. 26

3-10- واكنش  RT-PCRبرای ژن‏های  AlHA1و مرجع.. 26

3-11- تهیه ژل آگارز. 27

3-12- بافر( X50) TAE.. 28

3-12-1- محلول Tris 28

3-12-2- محلول اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 28

3-13- همسانه‌سازی قطعه مورد نظر در پلاسمید. 29

3-13-1- اتصال قطعه مورد نظر به درون ناقل پلاسمیدی.. 29

3-13-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری E. coli سویه DH5α. 30

3-13-3- انتخاب همسانه‌ها 31

3-13-4- کشت شبانه‌ی کلنی‌های مثبت.. 32

3-13-5- استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری به روش لیز کردن آلکالاینی.. 32

یک مطلب دیگر :

3-13-6- هضم آنزیمی پلاسمیدهای نوترکیب.. 35

3-14- آنالیز‏های آماری.. 36

فصل چهارم

نتایج و بحث… 37

4-1- آنالیز صفات مورفولوژیک… 37

4-1-1- وزن ریشه. 37

4-1-2-وزن ساقه. 39

4-1-3- وزن کل گیاه 40

4-1-4-طول ریشه. 41

4-1-5- طول ساقه. 41

4-1-6-طول کل گیاه 42

4-2- اندازه‌گیری عناصر در گیاه. 43

4-2-1- جیوه 44

4-2-2- سرب.. 44

4-2-3- نقره 45

4-3- کمیت و کیفیت دی‌ان‌ا استخراج شده. 46

4-4- استخراج RNA از برگ گیاه A. littoralis. 46

4-5 – واکنش زنجیره‌ای پلیمراز PCR 47

4-6- بررسی بیان ژن Alha1 تحت تنش فلزات سنگین  و شوری به روش نیمه کمی.. 48

4-6-1- بررسی اثر سطوح مختلف سرب در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1  49

4-6-2- بررسی اثر سطوح مختلف نقره در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1  50

4-6-3- بررسی اثر سطوح مختلف کلرید سدیم در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1  52

4-6-4- بررسی اثر سطوح مختلف جیوه در زمان‌های مختلف پس از اعمال تیمار بر بیان ژن Alha1  53

4-7- همسانه‌سازی محصول پی‏سی‏آر. 56

4-8 – نتیجه‏ گیری.. 57

4-9- پیشنهادات.. 58

مقدمه

1-1- تنش

در محیط‏های طبیعی و شرایط زراعی، گیاهان به دفعات در معرض تنش‏های محیطی قرار می‏گیرند. تنش معمولاً به عنوان یک عامل خارجی که باعث تأثیر منفی بر زندگی گیاه می‏شود تعریف می‏شود. مفهوم واژه تنش همواره با تحمل تنش همراه است که قابلیت گیاه در رو به رو شدن با شرایط نامساعد محیطی است. تطابق و سازگاری به تنش‏های محیطی ناشی از تغییرات در سطوح مختلف اندام‏های موجود زنده از سطح آناتومیک و مورفولوژیک تا سطوح سلولی، بیوشیمیایی و مولکولی رخ می‏دهد. واکنش‏های سلولی به تنش شامل تغییر در چرخه سلولی و تقسیم سلولی، تغییر در سیستم غشاهای داخلی و واکوئلی سلول و تغییر در ساختار دیواره سلولی است که در تمام این پاسخ‏ها شاهد تغییر الگوی بیان ژن یا ژن‏هایی هستیم است که محصول آن‏ها در تنش مؤثر هستند (Taiz and Zeiger, 1991).

1 -2 – شوری خاک

سابقه شوری خاک به اندازه تمدن بشری است و احتمالاً دلیل انقراض تمدن باستانی سومر، شور شدن خاک بوده است (Jacobsen and Adams, 1958). امروزه نیز شوری یکی از تنش‏های غیر زنده مهم به شمار می‏رود که  اثرات زیانباری بر عملکرد و کیفیت محصول دارد (Boyer, 1982). در آسیا بیشترین مساحت اراضی شور پس از کشورهای آسیای میانه، هندوستان و پاکستان در ایران قرار دارد. از کل مساحت ایران که 165 میلیون هکتار است، حدود 44 میلیون هکتار آن تحت تاثیر شوری بوده که نزدیک به 30 درصد دشت‏ها و متجاوز از 50 درصد اراضی تحت کشت آبی کشور را تشکیل می‏دهد (Pillaya et al., 2005). منبع اصلی که خاک را شور می‏کند نمک‏های محلولی است که در منابع آب زیر زمینی وجود دارد. برآورد شده است که تقریباً 15 درصد از اراضی ایران تحت تأثیر نمک با درجات مختلف قرار دارد (ملکوتی و همکاران، 1381). شوری خاک و آب‏های کم کیفیت از جمله مشکلات جدی در تولید محصولات کشاورزی می‏باشند. ایران از جمله کشور‏هایی است که با کمبود آب آبیاری و مشکل خاک روبرو است. مشکل شوری به خاطر زیاد بودن تبخیر از سطح خاک، بارندگی کم، پستی و بلندی زمین‏ها، آبیاری با آب دارای کیفیت نامناسب و سنگ‏های نمکی است. عوامل فوق باعث به وجود آمدن شوره‏زار‏های زیادی شده است. در سال‏های اخیر روند شور شدن خاک‏ها افزایش یافته و هکتار‏ها زمین قابل کشت به علت تجمع بیش از حد نمک غیر قابل کشت شده‏اند (Pillaya et al., 2005).

1-3- اثرات شوری بر گیاهان

شوری برای رشد گیاه یک عامل محدود کننده است بدان سبب که باعث ایجاد محدودیت‏های تغذیه‏ای از طریق کاهش جذب فسفر، پتاسیم، نیترات و کلسیم و افزایش غلظت یونی درون سلولی و تنش اسمزی می‏شود (Guo et al., 2001). در اثر شوری، پتانسیل آب محیط می‌تواند از پتانسیل آب گیاه منفی‌تر شود و همین امر جذب آب توسط گیاه را با مشکل روبه‌رو می‌کند (کافی و مهدوی دامغانی، 1379). در شرایط وقوع شوری، یون‏هایی مثل Na⁺ و Cl^–، به داخل لایه‏های هیدراسیونی پروتئین‏ها نفوذ کرده، سبب اختلال در کار پروتئین‏ها می‏شوند. مسمومیت یونی، تنش اسمزی و کمبود مواد مغذی که در شرایط وقوع شوری رخ می‏دهد، سبب بهم خوردن توازن یونی و در پی آن تنش اکسیداتیو می‏شوند (Guo et al., 2001). کاهش رشد در گیاهان تحت شرایط تنش شوری می‏تواند به دلیل کاهش ذخایر انرژی گیاه باشد که این متأثر از کاهش و اختلال فعالیت‏های زیستی و متابولیسمی گیاه می‏باشد (Kerepesi and Galiba, 2000).