عنوان:

 

بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب  FGFR2b و بررسی تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش با فلزات سمی

 

 

 

استاد راهنما:

 

دکتر نعمت الله غیبی

 

 

 

اساتید مشاور:

 

دکتر داریوش ایلغاری

 

دکتر مجید سیرتی ثابت

 

زمستان 93

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست اختصارات  

AB: Acid Box

Al: Aluminium

AP-1: Activator protein 1

APS: Ammonium Persulfate

ASK: Apoptosis signal-regulating kinase

ATP: Adenosine Triphosphate

BDNF: brain-derived neurotrophic factor 

Beas-2B: Human bronchial epithelial cells

BFGF: Basic Fibroblast Growth Factor

CA-1: cornu ammonis 1

CaMKII: Ca²+–calmodulin dependent protein kinase II

CAMs: Calcium-Modulated Protein

CCR7: C-C chemokine receptor type 7

Cd: Cadmium

CD: Circular Dichroism 

CHO: Chinese hamster ovary

CNS: central nervous system

DAG: diacylglycerol

DGK: Diacyl glycerol kinase

DLS: Dynamic light scattering

DNA: Deoxyribonucleic acid 

ERK: Extracellular Signal-Regulated Kinases

FDA: Food and Drug Administration

FGFBP: Fibroblast growth factor binding protein

FGFR: Fibroblast Growth Factor Receptor

Fgp: Floral Genome Project

FRS2: Factor receptor substrate 2

FTIR: Fourier Transform Infrared Spectroscopic

Gab1: Grb2-associated binder-1

GnHCl: Guanidinium Hydrochloride

GDP: guanidine di-phosphate

GRB2: growth factor receptor-bound protein 2 

GST: Glutathione S-Transferase

GTP: guanidine tri-phosphate

HEPES: Hydroxyethyl-Piperazine Ethanesulafonic Acid

HIF-1: Hypoxia-inducible factor 1

HSGAG: Heparan Sulfate Glycosaminoglycan

IARC: Agency for Research on Cancer

IL: Interleukin

IP3: inositol 1, 4, 5-trisphosphate

IPTG: Isopropyl β- D -1-thiogalactopyranoside

IQ: intelligence quotient

Itk: Interleukin-2inducible T cell kinase

JNK: c-Jun NH2-terminal kinase

KD: kinase domain

LADD: Lacrimo-auriculo-dento-digital

LTP: long-term potentiation

MAPK: mitogen-activated protein kinase

MBP: Maltose-Binding Protein

NFAT: Nuclear factor of activated T cell

NF-kB:  nuclear factor kappa beta

Ni: Nickle

NTA: Ni (2+)-Nitrilotriacetic Acid– 2+ Ni

NMDAR: N-methyl-D-aspartate receptor

NO: nitric oxide

NTP: National Toxicology Program

PA: phosphatidic acid

Pb: Plumbum (Lead)

PI3K: Phosphatidylinositol-3 kinase

PIP3: Phosphatidylinositol (3, 4, 5)-trisphosphate

PLEICS-01: Plasmid Leicester-01

PMT: Photomultiplier tubes

PTP: Protein-Tyrosine Phosphatase

RAF: rapidly accelerated fibrosarcoma

RNA: Ribo nucleic acid

ROS: Reactive oxygen species

SAPK: stress-activated protein kinase

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis PAGE

Sef: similar expression to FGF genes

SH3: Src homology 3

SOD: Superoxide dismutase

TEMED: N, N, N’, N’ – tetramethyethylenediamine

TNF: Tumor necrosis factor

TRE: Transcriptional Response Element

TRPC3: canonical transient receptor potential protein 3

WHO: World Health Organization

فهرست شکل ها و جداول:

شکل 1 : نحوه عملکرد کلی FGF و FGFR

شکل 2 : گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع 2

شکل 3 : ساختمان کلی RTK و انواع FGFR

شکل 4 : ساختمان اصلی یک اسید آمینه

شکل 5 : ساختمان اول، دوم، سوم و چهارم پروتئین

شکل 6 : دسته بندی گیرنده های تیروزین کینازی

شکل 7 : ساختار فاکتورهای رشد فیبروبلاست

شکل 8 : ساختار کریستالی کمپلکس FGF10–FGFR2b

شکل 9 : ا گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی و نواحی فسفریله شدن آن

شکل 10 : برخی از بیماریها و موتاسیون های نقطه ای پاتولوژیک گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی

شکل 11 : مسیر پیام رسانی گیرنده های فاکتور های رشد فیبروبلاستی

شکل 12 : مسیر پیام رسانی Ras/MAPK

شکل 13 : مسیر پیام رسانی  PLCy/Ca+2

شکل 14: مسیر پیام رسانی  PI3-K/Akt

شکل 15: مسیر سیگنالینگ ROS

شکل 16: پروتئین کیناز فعال کننده میتوژن

شکل 17 : مسیر فسفاتیدیل اینوزیتول-3 کیناز

شکل 18 : فاکتور رونویسی القاء شده 1

شکل 19: مسیر سیگنالینگ NF-kB

شکل 20 : فاکتور هسته ای فعال کننده سلول T

شکل 21: مسیر پیام رسانی AP-1

شکل 22 : عملکرد رسپتور NMDAR و فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز

شکل 23: اثر کادمیوم بر مسیر سیگنالینگ

شکل 24: انواع مسیرهای سیگنالینگ MAPK

شکل 25: اثر نیکل بر مسیر سیگنالینگ

شکل 26: آبشار سیگنالینگ فسفولیپید

شکل 27: ساختار شیمیایی اسیدآمینه های تیروزین ، تریپتوفان و فنیل آلانین

شکل 28: دیاگرام جابلونسکی

شکل 29: دناتوراسیون پروتئین

شکل 30: ساختار شیمیایی اوره و گوانیدین هیدروکلراید

شکل 31: پروتئین های نوترکیب و مزایا

شکل 32: استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین

شکل 33: توالی ژنی ناحیه کینازی و نقشه شماتیک از پلاسمید pLEICS–01

شکل 34: شمای کلی از روش ترانسفورماسیون

شکل 35: روش انجام SDS–PAGE به منظور بررسی بیان پروتئین

شکل 36: تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی

شکل 37: اسپکتروفلوریمتری Cary مدل Bio700 (Spectrofluorimetry)

شکل 38: اسپکتروسکوپی CD مدلJasco – J810  Circular dichroism spectroscopy))

شکل 39: اسپکتروسکوپی FTIR مدل (Infrared spectroscopy) Perkin-Elmer Spectrum RXI

شکل 40: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coli در دمای 37 درجه سانتی گراد

شکل 41: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری  E.coliدر دمای 20 درجه سانتی گراد

شکل 42: مقایسه‏ی حلالیت ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در دو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد

شکل 43: خالص‏سازی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی حاوی Ni²+-NTA

شکل 44: نتایج SDS-PAGE بعد از دیالیز

شکل 45: بررسی عملکرد ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b خالص شده

شکل 46: بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه‏ی تیروزین  کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده از دستگاه CD

شکل 47: بررسی تاثیر سرب بر پروتئین مورد نظر در دستگاه FTIR

شکل 48: بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b

شکل 49: بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b

شکل 50: بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b

جدول 1: جدول متغیرها

جدول2: خصوصیات فلوئورسنس اسیدآمینه های آروماتیک

جدول 3: رنج نرمال و سمی فلزات سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل در مایعات بدن.

فهرست مطالب

فصل اول     مقدمه و اهمیت موضوع. 3

1-1- مقدمه 4

1-1-1- فاکتور رشد فیبروبلاستی. 4

1-1-2- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست.. 4

1-1-3- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست نوع 2. 5

1-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی تیروزین کینازی.. 6

1-1-5- فعال سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون. 8

1-2- اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق. 9

1-3- اهداف طرح 9

1-3-1- هدف اصلی. 9

1-3-2- اهداف فرعی. 9

1-3-3- اهداف کاربردی.. 10

1-3-4- فرضیات.. 10

1-3-5- متغییرها 10

فصل دوم      مروری بر متون گذشته. 11

2-1- پروتئین 12

2-1-1- ساختمان پروتئین ها 13

2-1-2- گیرنده های تیروزین کینازی.. 17

2-1-3- فاکتورهای رشد فیبروبلاستی. 18

2-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی. 20

2-1-5- گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی و اختلالات پاتولوژیکی. 22

2-1-6- مسیر پیام رسانی سلولی فاکتورهای رشد فیبروبلاستی. 25

2-1-7- تنظیم مسیر پیام رسانی فاکتور های رشد فیبروبلاستی. 29

2-2- فلز چیست؟ 31

2-2-1- فلزات سمی. 31

2-2-3- سرب.. 32

2-2-4-کادمیوم 32

2-2-5- نیکل. 33

2-2-6-آلومینیوم 33

2-7- تاثیر فلزات بر مسیرهای سیگنالینگ. 34

2-7-1-ROS. 34

2-7-2- MAPK.. 35

2-7-3- PI3K/Akt 36

2-7-4- HIF. 37

2-7-5- NF-kB.. 38

2-7-6- NFAT. 39

2-7-7- AP. 40

2-8- اثر ترکیبات فلزی بر مسیرهای سیگنالینگ و بیان ژن 41

2-8-1- سرب.. 41

2-8-2- کادمیوم 43

2-8-3- نیکل. 46

2-8-4- آلومینیوم 48

2-9- پیشگویی ساختمان پروتئین ها 50

2-9-1- بررسی ساختار پروتئین ها 50

2-9-2- مطالعه ی ساختاری پروتئین ها 51

2-9-3- تکنیک های مطالعه ی ساختار پروتئین  ها 52

2-9-4- تکنیک فلوئورسانس اسپکتروسکوپی. 53

2-9-5- تکنیک دورنگ نمایی حلقوی(CD) 56

2-9-6- تکنیک ها و عوامل دناتوراسیون. 57

2-10- تکنیک های تولید و تخلیص پروتئین های نوترکیب. 60

2-10-1- كاربرد پروتئین های نوتركیب. 60

 

2-10-2- پروتئین های نوترکیب (Recombinant proteins ) 60

2-10-3- تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان. 63

2-10-4- استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین. 64

2-10-5- خالص سازی پروتئین های نوترکیب.. 64

فصل سوم   مواد و روش ها. 66

3-1- مواد، تجهیزات و متغیر ها ی آزمایش. 67

3-1-1- مواد مورد استفاده در آزمایش.. 67

3-1-2- دستگاه ها و تجهزات مورد استفاده در آزمایش.. 68

3-2- محلول ها و بافرها 69

3-2-1- تهیه ی استوک آمپی سیلین. 69

3-2-2- تهیه ی استوک IPTG.. 70

3-2-3- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت بررسی حلالیت پروتئین. 70

3-2-4- تهیه ی بافر لیز کننده  سلول جهت تخلیص پروتئین. 70

3-2-5- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 4%… 70

3-2-6- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 12%… 71

3-2-7- تهیه ی محلول  APS10%… 71

3-2-8- تهیه ی بافر الکترود x10  (Running buffer) 71

3-2-9- تهیه ی بافر نمونه Sample Buffer)) 71

3-2-10- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/0 مولار. 72

3-2-11- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/1 مولار. 72

3-2-12- تهیه ی Staining Buffer 72

3-2-13- تهیه ی Destaining Buffer 73

3-2-14- تهیه ی محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید 73

3-2-15- تهیه بافر SDS. 73

3-2-16- تهیه بافرA (Washing Buffer) 73

3-2-17- تهیه بافر B (   (Eluting Buffer 74

3-2-18- تهیه بافر دیالیز. 74

3-2-19- تهیه استوک گوانیدین هیدروکلراید (GnHCl) 74

3-2-20- تهیه استوک فلزات.. 74

3-2-21- آماده سازی محیط های کشت باکتری.. 74

3-3- روش انجام کار 75

3-3-1- نمایش ساختار پلاسمید نوترکیب pLEICS-01 و توالی ژنی ناحیه تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b. 75

3-3-2- مراحل تولید پروتئین نوترکیب.. 77

3-3-3- تعیین غلظت پروتئین. 83

3-3-4- مطالعات اسپکتروسکوپی فلوئورسانس.. 83

3-3-5- مطالعات اسپکتروسکوپی دورنگ نمایی حلقوی CD)) 85

3-3-6- مطالعات اسپکتروسکوپی FTIR.. 86

یک مطلب دیگر :

3-3-7- مطالعات دناتوراسیون شیمیایی با استفاده از اسپکتروسکوپی فلوئورسانس.. 87

فصل چهارم یافته ها و نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………………. …………………………………………………………………………………………………………………………………. 88

4-1- بررسی بیان پروتئین در دمای 37 درجه سانتی گراد 88

4-2- بررسی بیان پروتئین در دمای20 درجه سانتی گراد 89

4-3- بررسی  حلالیت پروتئین بیان شده دردو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد 90

4-4- بررسی میزان خلوص پروتئین محلول شده 91

4-5- آنالیز SDS-PAGE بعد از دیالیز 92

4-6- بررسی عملکرد پروتئین خالص شده 93

4-7- بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 94

4-8- بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 98

4-9- بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسانس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 101

4-10- بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 104

فصل پنجم      بحث و نتیجه گیری.. 109

5-1- بحث و نتیجه گیری. 110

فهرست منابع: 116

….………………………………………………………………………………..Abstract125

 

چکیده

زمینه: عوامل رشد فیبروبلاست (FGF) و گیرنده های آنها (FGFR) نقش اساسی در سلول ایفا می کنند. عدم تنظیم در مسیرهای سیگنالینگ FGF / FGFR با بسیاری از ناهنجاری ها و گسترش سرطان همراه است. از این گروه گیرنده‏ فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو در مسیر پیام‏رسانی سلولی و تنظیم فرآیندهای مهم زیستی از جمله تمایز و تکثیر سلولی نقش اساسی دارد. اختلال در انتقال پیام این گیرنده با چندین اختلال پاتولوژیکی انسانی مرتبط می باشد. در این میان مسمومیت با فلزات سمی نیز یکی از مشکلات عمده در زیست شناسی سلولی است که اثرات آنها بر مسیرهای مختلف سیگنالینگ به اثبات رسیده است.

هدف: این مطالعه به منظور تخلیص ناحیه کینازی FGFR2b و بررسی اثر فلزات سمی سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بر ساختار ناحیه کینازی رسپتور فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو انجام شد.

مواد و روش‏ها: در این مطالعه تجربی پروتئین نوترکیب با استفاده از پلاسمیدpLEICS-01 ، باکتری BL21، القائ IPTG ، الکتروفورز و ستون حاوی Ni2+ -NTA بیان و خالص شد. فعال بودن نمونه پروتئین بعد از دیالیز توسط تعامل با ناحیه SH2 فسفولیپاز(PLC)C طبیعی و موتان توسط روش PAGE بررسی شد. طیف فلوئورسانس، CD, FTIR و دناتوراسیون شیمیایی پروتئین خالص شده در حضور غلظت های مختلف سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بررسی و ارزیابی گردید.

یافته‏ها: بررسی SDS-PAGE قبل و بعد از القا شدن نشان داد که پروتئین بیان شده در دمای 20 درجه سانتی گراد محلول است. نتایج PAGE فعال بودن پروتئین خالص شده را تأیید کرد. بررسی طیف سنجی فلوئورسانس کاهش شدت نشر را با افزایش تدریجی غلظت هر چهار فلز سمی نشان داد. طیف CD نشان داد ناحیه ی کینازی مورد مطالعه ما دارای ترکیب بتای بیشتری نسبت به آلفا می باشد و نیز حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم در محلول، ساختار دوم کیناز را تغییر نمی دهد، ولی سرب قادر به تغییر این ساختار می باشد. آزمایش انجام شده توسط FTIR نیز اثر سرب را تایید کرد. دناتوراسیون شیمیایی ساختار سوم در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم ناحیه کینازی را تغییر نداد. ولی این تغییر در حضور سرب مشاهده شد.

بحث و نتیجه‏گیری: باتوجه به یافته ها، ناحیه‏ کینازی گیرنده‏ نوترکیب عامل رشد فیبروبلاستی 2b که یک پروتئین 38 کیلودالتونی است تولید و خالص گردید و نشان داده شد که به صورت محلول و فعال است. تغییرات ساختار سوم و دوم ناحیه کینازی موجب ناپایدار شدن آن در حضور سرب گردید. این ناپایداری در سطح مولکولی می تواند موجب اختلال در مسیر پیام رسانی سلول شود. گرچه این ناپایداری در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم مشاهده نشد.

کلیدواژه‏ها: گیرنده‏ فاکتور رشد فیبروبلاستی، ناحیه کینازی، سیگنالینگ، فلزات سمی، طیف سنجی فلوئورسانس، CD،  FTIR

– مقدمه

 

1-1-1- فاکتور رشد فیبروبلاستی