2-4- محیط کشت باکتریها…………………………………………………………………….26
2-5- آنتیبیوتیکها……………………………………………………………………………27
2-6- طراحی آغازگر………………………………………………………………………….27
2-7- شناسایی و جداسازی باکتری Xcc…………………………………………………………………………………….29
2-8- خالص سازی DNA ژنومی باکتری Xcc سویهی ………………………..NIGEB.088(A*)31
2-9- تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده……………………………………………….31
2-10- واکنش زنجیرهای پلیمراز با آنزیمهایTaq و Pfu دی.ان.آ پلیمراز جهت جداسازی ژنهای هدف……………………………………………………………………………………………………………………………………..31
2-11- الکتروفورز محصولات واکنش زنجیرهای پلیمراز……………………………………………33
2-12- خالصسازی محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز………………………………………….33
2-13- جداسازی محصول PCR و یا محصول حاصل از هضم آنزیمی از روی ژل آگارز……………34
2-14- هضم آنزیمی با آنزیمهای محدود کننده تیپ …………………………………………..II35
2-15- الکتروفورز محصولات واکنشهای هضم آنزیمی…………………………………………39
2-16- واکنش اتصال………………………………………………………………………….39
2-17- تکثیر پلاسمید………………………………………………………………………….42
2-18- اندازهگیری دانسیته نوری(OD) باکتری…………………………………………………..42
2-19- تکنیک Colony-PCR: غربالگری کلونیهای نوترکیب……………………………………42
2-20- استخراج پلاسمید در مقیاس کم ……………………………………(Mini-Preparation)43
2-21- توالییابی………………………………………………………………………………43
2-22- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس با استفاده از روش ذوب و انجماد…………………………………………………………………43
فصل سوم: نتیجهگیری و بحث
3- شناسایی باکتری Xcc (A*)……………………………………………………………………………………………………………………..47
3-1- شناسایی به کمک تست بیماریزایی بر روی گیاه میزبان C.auratifolia…………………………………47
3-2- شناسایی به کمک آغازگرهای اختصاصیMS+/MS- و Xac01 / Xac02……………………………….48
3-3- استخراج DNA ژنومی از باکتری XCC……………………………………………………………………………49
3-4- تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده………………………………………………50
3-5- تکثیر ژنهایhrpW و hrpG با واکنش زنجیرهای پلیمراز………………………………….51
3-5-1- طراحی آغازگرهای مناسب……………………………………………………………51
3-5-2- بهینهسازی شرایط واکنش زنجیرهای پلیمراز……………………………………………51
3-5-3- الکتروفورز محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز………………………………………….53
3-6- تایید ناقلهای کلونینگ و بیانی از طریق الگوهای برشی حاصل از هضم توسط آنزیمهای برشی نوع II…………………………………………………………………………………………………………………………………….54
3-7- همسانهسازی ژنهایhrpG و hrpW در ناقلهای کلونینگ (PGEM7zf(-) , pUC19)………….55
3-8- تایید همسانهسازی ژنهای هدف در ناقلهای کلونینگ (pGEM7zf(-))،( pUC19)………………57
3-8-1- واکنش کلونی PCR کلونهای گزینش شده……………………………………………57
3-8-2- تایید همسانهسازی ژنهایhrpW/G در ناقلهای کلونینگ با روش هضم آنزیمی…………58
3-8-3- تایید همسانهسازی ژنهای hrpW/G در ناقلهای کلونینگ با روش واکنش زنجیرهای پلیمراز……………………………………………………………………………………………………………………………………59
3-9- همسانه سازی ژنهای hrpG/W در ناقل بیانی pBI121………………………………………………………59
3-10- تایید همسانه سازی ژنهای hrpG/W در ناقل بیانی pBI121…………………………………………….62
3-10-1- واکنش کلونی PCR کلونهای تشکیل شده……………………………………………62
3-10-2- تایید همسانهسازی ژنهای hrpG/W در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش هضم آنزیمی.63
3-10-3- تایید همسانهسازی ژنهای hrpW/G در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش زنجیرهای پلیمراز……………………………………………………………………………………….64
3-11- توالییابی……………………………………………………………………………..65
3-11-1- نتایج توالییابی……………………………………………………………………..66
3-12- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpG و pBI.hrpW به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس.67
3-13- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس……..67
3-13-1- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G با روش کلونی PCR…………………………..67
فصل چهارم: جمعبندی کلی و پیشنهادها
4- جمعبندی کلی نتایج……………………………………………………………………….70
4-1- پیشنهادها………………………………………………………………………………71
پیوست
5- دستورالعمل استخراج و خالصسازی DNA ژنومی باکتری xanthomonas citri pv. citri سویه 088(A*) NIGEB-……………………………………………………………………………………………………………………………………84
5-1- محلولهای لازم جهت استخراج DNA ژنومی……………………………………………84
5-1-1- مراحل استخراج DNA ژنومی…………………………………………………………85
5-1-2- روش اسپکتروفوتومتری………………………………………………………………86
5-1-3- الکتروفورز بر روی ژل آگارز………………………………………………………….87
6- الکتروفورز با ژل آگارز……………………………………………………………………………………. 88
6-1- نمای ساده از دستگاه الكتروفورز…………………………………………………………88
6-2- ژل آگارز……………………………………………………………………………….89
6-3- اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………….89
6-4- بافر بارگزاری ژل آگارز………………………………………………………………….90
6-5- طرز تهیه محلول …………………………………………………………….TBE 0.5X91
6-6- طرز تهیه آگارز 1%……………………………………………………………………………………………..91
7- دستورالعمل خالصسازی فرآوردههای تکثیر شده و قطعات DNA از روی ژل آگارز…………………92
7-1- خالصسازی فرآوردههای تکثیر شده با کیت ……………………………………..Bioneer92
7-2- خالصسازی قطعات DNA از ژل آگارز……………………………………………………………………………93
8- دستورالعمل تهیه باكتریهای مستعد برای پذیرش DNA خارجی…………………………………….95
8-1- تهیه سلولهای مستعد E.coli……………………………………………………………………………95
8-2- دستورالعمل تراریزش باکتری مستعد به روش شوک حرارتی………………………………………………96
8-3- تهیهی سلولهای مستعد و انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس با استفاده از روش ذوب و انجماد……………………………………………………….97
9- استخراج پلاسمید در مقیاس کم از باکتری E.coli سویه DH5α……………………………………………..99
9-1- استخراج پلاسمید به روش دستی…………………………………………………………99
9-2- استخراج پلاسمید با استفاده از کیت MBST (دکتر شایان)…………………………………….101
9-3- روش تهیه محلول های IPTG و …………………………………………………X-Gal103
9-3-1- تهیه محلول ایزوپروپیل D-B تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)…………………………………………….103
9-3-2- تهیه 5 برمو-3 کلرو- اتیدولیل D-B گالاکتوزید (X-Gal)………………………………103
10- تهیه مایه تلقیح و بهینهسازی شرایط مایهزنی گیاه میزبان……………………………………………………..103
فهرست جداول
1-1- بیماریزایی فرمهای مختلف شانکر روی چهار گونه از مرکبات…………………………………. 12
1-2- مشخصات آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر و شناسایی…………………………………………. 29
2-2- برنامه Multipelex PCR با آغازگرهای MS+/MS- و Xac01/Xac02……………………… 30
3-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش Multipelex PCR جهت شناسایی باکتری……………. 30
4-2- شیب دمایی بهکار رفته برای تعیین بهترین دمای اتصال با آنزیم Taq…………………………. 32
5-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش زنجیرهای پلیمراز با آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز………. 32
6-2- چرخه حرارتی بهکار رفته برای تکثیر نهایی با آنزیم pfu…………………………………………. 33
یک مطلب دیگر :
7-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpW و ناقل همسانهسازی مربوطه (pGEM7zf(-))……………. 36
8-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل همسانهسازی مربوطه (pUC19)…………………….. 36
9-2- شرایط واکنش دوتایی هضم آنزیمی جهت تایید ناقلهای همسانهسازی ((-)pGEM7zf) و (pUC19)…………………………………………………………………………………………………………….. 37
10-2– شرایط واکنش هضم دوتایی آنزیمی جهت تایید ناقل بیانی(pBI121)…………………….. 37
11-2- شرایط واکنش هضم آنزیمی ژن hrpW و pBI121 جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل………………………………………………………………………………………………………………………. 38
12-2– شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل بیانی جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل…………………………………………………………………………………………………………………………. 38
13-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpG)………………………………………………………….. 40
14-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpW)…………………………………………………………… 40
15-2- شرایط واکنش اتصال (pUC19-hrpG)……………………………………………………………. 41
16-2- شرایط واکنش اتصال (pGEM7zf(-)-hrpW)…………………………………………………… 41
17-2- چرخه حرارتی بهکار رفته برای واکنش کلونی PCR به منظور تایید همسانهسازی در وکتور بیانی…………………………………………………………………………………………………………………….. 45
18-2- ترکیبات محلول مادری واکنش زنجیرهای کلونی PCR جهت تایید عمل همسانهسازی دروکتورهای کلونینگ و بیانی…………………………………………………………………………………… 45
1-5- مواد و مقدار مورد نیاز جهت تهیه بافر Loading dye……………………………………………… 9
فهرست شکلها
1-3- تست بیماریزایی روی لیمو………………………………………………………………………………………………48
2-3- تست (Xaco1 / Xaco2 / MS+/MS) Multiplex PCR……………………………………………………..49
3-3- اکتروفورزDNA ژنومی استخراج شده بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………..50
4-3- واکنش زنجیرهای پلیمراز با Taq دی.ان.آ پلیمراز و گرادیان دمایی جهت بهینهسازی بهترین دمای اتصال با پرایمرهای اختصاصی………………………………………………………………………………………………….53
5-3- واکنش زنجیرهای پلیمراز برای تکثیر ژنهای hrpG , hrpW با آغازگرهای اختصاصی و آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز………………………………………………………………………………………………………………………..53
6-3- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقلهای کلونینگ و بیانی با آنزیمهای برشی نوع II بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………………………………………………………………………………………..54
7-3- هضم آنزیمی فراورده ژنهایhrpG و hrpW جهت بازیابی از روی ژل آگارز)الف) و قطعات بازیابی شده(ب)………………………………………………………………………………………………………………………55
8-3- هضم آنزیمی ناقلهای کلونینگpUC19 و pGM7zf(-) جهت بازیابی از ژل آگارز(الف) قطعات بازیابی شده(ب)……………………………………………………………………………………………………………………..55
9-3- واکنش کلونی PCR برای کلونهای سفید حاصل ازhrpG و hrpW……………………………………58
10-3- هضم آنزیمی پلاسمیدهای استخراج شده از کلونیهای حاصل از واکنش اتصال pGEM و hrpw و همچنینhrpG و pUC19……………………………………………………………………………………………………..58
11-3- الکتروفورز محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز پلاسمیدهای تایید شده بر روی ژل آگارز 1%….59
12-3- هضم آنزیمی ناقل بیانی جهت بازیابی از روی ژل آگارز (الف) قطعات بازیابی شده (ب)……..61
13-3- فراورده بازیابی شده ناقل بیانی و ژنهای hrpW/G جهت تعیین نسبت واکنش اتصال…………..62
14-3- واکنش کلونی PCR تعدادی از کلونهای حاصل از مخلوط اتصال وکتور pBI121 و ژنهای hrpG و hrpW……………………………………………………………………………………………………………………….63
15-3- هضم آنزیمی دوتایی پلاسمیدهای نوترکیبpBI.hrpG و pBI.hrpW با آنزیمهایXbaI/BamHI XbaI/SacI……………………………………………………………………………………………………………………………..64
16-3- واکنش زنجیرهای پلیمراز برای پلاسمیدهای نوترکیبpBI.hrpG و pBI.hrpW جهت بررسی حضور ژنهای مذکور……………………………………………………………………………………………………………..65
17-3- پلاسمیدهای نوترکیب استخراج شده……………………………………………………………………………..66
18-3- واکنش کلونی PCR تعدادی از کلونهای حاصل از انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس…………………………………………………………………………………………. 68
چکیده
بیماری شانکر بهوسیلهی باکتری (Xanthomonas citri pv. citri) ایجاد میشود که هر ساله عملکرد و کیفیت محصولات خانواده مرکبات، بهویژه لیموترش و پرتقال را تحت تاثیر خود کاهش میدهد. این پژوهش با هدف جداسازی و همسانهسازی دو ژن رمز کنندهی هارپینهای HrpW و HrpG از باکتری Xcc سویه NIGEB-088 و ساخت پلاسمیدهای نوترکیب pBI-hrpG و pBI-hrpW بهمنظور توسعهی استراتژی مقاومت به بیماری شانکر بر مبنای القای واکنش دفاعی در گیاه لیموترش انجام شد. بدین منظور آغازگرهای اختصاصی (رفت و برگشت) برای تکثیر این ژنها با استفاده از توالی کامل DNA ژنومی باکتری عامل این بیماری، طراحی شد. ژنهای تکثیر شده سپس به منظور همسانهسازی، در پلاسمیدهای pGEM7zf(-) و همچنین pUC19 به ترتیب برای ژنهای hrpW و hrpG، با جایگاههای برشی XbaI و SacI و همچنین XbaI وBamHI وارد شد و پلاسمیدهای نوترکیب در باکتری E.coli سویه DH5α تراریخت شدند. به منظور بیان ژنها در گیاه، قطعهی مورد نظر در ناقل pBI121 و در جایگاههای برشی برای ژنهای هدف همسانهسازی شد، بهطوری که ژنهای مورد نظر تحت کنترل پیشبر ویروس موزائیک گل کلم 35S و پایانبر NOS در ناحیهی DNA T- این ناقل قرار گرفت. با استفاده از واکنش زنجیرهای پلیمراز، هضم آنزیمی و توالییابی حضور ژنهای هدف در کلونیهای مثبت مورد تایید قرار گرفت. این ناقلهای پلاسمیدی نوترکیب را میتوان در انتقال ژن به گیاهان حساس به این بیماری مانند لیمو ترش و پرتقال با استفاده از آگروباکتریوم مورد استفاده قرار داد. در نهایت پلاسمیدهای نوترکیب به سویههای مورد نظر آگروباکتریوم تومفاسینس منتقل و حضور ژنهای مربوطه مورد تایید واقع شد. سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس تایید شده در برنامههای انتقال ژن مورد استفاده قرار خواهند گرفت.
