2-1-2-2. الیگو ساکارید مرکزی………………………………………………………………………………………………………….. 17

2-1-2-3. لیپید A……………………………………………………………………………………………………………………………….. 18

2-1-3. کاربرد لیپو پلی ساکارید در مطالعات ایمونولوژیکی………………………………………………………………. 19

2-1-3-1. نقش لیپو پلی ساکارید باکتریایی در افزایش پاسخ ایمنی به کاندیدا آلبیکنز……………….. 19

2-1-3-2. نقش لیپو پلی ساکارید در تسریع ترمیم زخم اپیتلیوم مجاری تنفسی…………………………. 21

2-1-3-3. قابلیت میتوژنی لیپو پلی ساکارید در تکثیر لنفوسیت‌های B…………………………………………. 21

2-1-3-4. اثر لیپو پلی ساکارید بر پرولیفراسیون فیبروبلاست‌ها………………………………………………………. 22

2-1-3-5. اثر سینرژیسمی‌پروتئین نوترکیب CagA و لیپو پلی ساکارید در بروز پاسخ ایمنی مناسب علیه هلیکوباکتر پیلوری…………………… 23

2-1-3-6. نقش حفاظتی لیپو پلی ساکارید در بقای پیوند سلول‌های بنیادی…………………………………. 24

2-1-3-7. فعالیت ضد سرطانی لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………… 25

2-2. سالمونلا………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 28

2-2-1. پاسخ ایمنی میزبان به عفونت سالمونلایی……………………………………………………………………………… 29

2-2-1-1. پاسخ ایمنی ذاتی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………………… 29

2-2-1-2. پاسخ ایمنی اکتسابی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………….. 30

2-2-1-3. سایتوکاین‌ها و کموکاین‌های دخیل در عفونت سالمونلایی……………………………………………… 30

2-3. التهاب…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-3-1. ویژگی‌های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-3-2. میانجی‌های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………… 32

2-4. لیپو پلی ساکارید و التهاب……………………………………………………………………………………………………………. 33

2-5. سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………………………………………… 34

2-5-1. تاریخچه ی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………………….. 35

2-5-2. ساختار پروتئینی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………… 35

 

2-5-3. سیکلو اکسیژناز‌ها و سنتز پروستانوئید‌ها………………………………………………………………………………… 36

2-5-4. اعمال پروستاگلاندین‌ها……………………………………………………………………………………………………………. 37

2-5-5. بیولوژی سیکلو اکسیژناز………………………………………………………………………………………………………….. 37

2-5-6. فیبروبلاست و سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………….. 38

2-5-7. نقش سیکلو اکسیژناز-2 در آنژیوژنز………………………………………………………………………………………. 39

2-5-8. سیکلو اکسیژناز و لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………………….. 40

2-6. هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………………………….. 43

2-6-1. تاریخچه‌ی هیدروژن پر اکسید………………………………………………………………………………………………… 43

2-6-2. بیولوژی هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………. 44

2-6-3. گونه‌های واکنشگر اکسیژن……………………………………………………………………………………………………… 45

2-6-4. ROS و منابع تولید آن……………………………………………………………………………………………………………. 46

2-6-5. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………………….. 47

2-6-7. ردوکس و تمایز سلول‌های بنیادی………………………………………………………………………………………….. 49

2-6-8. ردوکس و تمایز سلول بنیادین جنینی به سلول‌های ماهیچه صاف (SMC)………………………. 50

2-7. نیتریک اکسید………………………………………………………………………………………………………………………………. 51

2-7-1. سنتز نیتریک اکسید……………………………………………………………………………………………………………….. 52

2-7-2. عملکرد NOS…………………………………………………………………………………………………………………………… 53

2-7-3. نقش‌های فیزیولوژیکی NO…………………………………………………………………………………………………….. 53

2-7-4. اثر NO بر رگ‌های خونی……………………………………………………………………………………………………….. 53

2-7-5. نقش NO در سیستم ایمنی…………………………………………………………………………………………………… 54

2-7-6. نقش NO در التهاب………………………………………………………………………………………………………………… 54

2-7-7. نقش NO در سیستم عصبی………………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-8. NO و مرگ تدریجی سلول…………………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-9. نقش iNOS در القای COX-2……………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-10. نقش iNOS در تکثیر…………………………………………………………………………………………………………… 56

2-8. پوست…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 57

2-8-1. فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………………………………. 58

2-9. زخم……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 61

2-9-1. چگونگی ترمیم زخم طی روز‌های مختلف…………………………………………………………………………….. 61

2-9-1-1. 24 ساعت اول…………………………………………………………………………………………………………………….. 61

2-9-1-2. روز سوم……………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-1-3. روز پنجم……………………………………………………………………………………………………………………………… 62

2-9-1-4. هفته‌ی دوم………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-1-5. اواخر ماه اول……………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-2. مراحل ترمیم زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 63

2-9-2-1. مرحله‌ی التهابی…………………………………………………………………………………………………………………… 63

2-9-2-1-1. میانجی‌های شیمیایی التهاب…………………………………………………………………………………………. 67

2-9-2-1-2. پروستاگلاندین‌ها و لوکوترین‌ها……………………………………………………………………………………… 67

یک مطلب دیگر :

2-9-2-2. مرحله‌ی تکثیر…………………………………………………………………………………………………………………….. 67

2-9-2-2-1. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 68

2-9-2-2-2. فیبروپلازیا………………………………………………………………………………………………………………………. 68

2-9-2-2-3. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 69

2-9-2-3. مرحله‌ی بازسازی………………………………………………………………………………………………………………… 69

2-9-3. اهمیت ماکروفاژ‌ها در التیام زخم……………………………………………………………………………………………. 69

2-9-3-1. فنوتیپ ماکروفاژ‌های زخم………………………………………………………………………………………………….. 70

2-9-3-2. اثر ماکروفاژ‌ها بر فیبروبلاست‌ها و میو فیبروبلاست‌ها………………………………………………………. 71

2-9-3-3. ماکروفاژ‌ها در مرحله‌ی التهاب……………………………………………………………………………………………. 72

2-9-4. زخم و هیدروژن پراکسید……………………………………………………………………………………………………….. 73

2-9-4-1. اثرات مثبت استرس اکسیداتیو در التیام زخم………………………………………………………………… 77

2-9-4-1-1. انعقاد……………………………………………………………………………………………………………………………….. 77

2-9-4-1-2. آغاز و دوام فاز التهابی…………………………………………………………………………………………………… 78

2-9-4-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 78

2-9-4-1-4. آنژیوژنز و رسوب ماتریکس……………………………………………………………………………………………. 79

2-9-4-2. اثر منفی استرس اکسیداتیو و استرس نیترو اکسیداتیو در ترمیم زخم………………………… 80

2-9-5. نیتریک اکسید و زخم……………………………………………………………………………………………………………… 82

2-9-5-1. اثر مثبت نیتریک اکسید در ترمیم زخم………………………………………………………………………….. 82

2-9-5-1-1. التهاب……………………………………………………………………………………………………………………………… 83

2-9-5-1-2. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 83

2-9-5-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 83

2-9-5-1-4. رسوب ماتریکس و بازسازی…………………………………………………………………………………………… 84

2-9-5-2. کاربرد نیتریک اکسید در درمان زخم……………………………………………………………………………….. 85

فصل سوم: مواد و روش‌ها

3-1. مواد و وسایل و دستگاه‌های بکار رفته در آزمایش………………………………………………………………………. 89

3-2. طرز تهیه‌ی محلول‌ها و معرف‌های بکار رفته………………………………………………………………………………. 91

3-2-1. محیط کشت DMEM…………………………………………………………………………………………………………….. 91

3-2-2. FBS………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

3-2-3. بافر PBS…………………………………………………………………………………………………………………………………… 91

3-3. کشت سلول‌های فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………. 91

3-4. آماده‌سازی غلظت‌های مختلف لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………….. 92

3-5. تیمار لیپو پلی ساکاریدی فیبروبلاست‌ها…………………………………………………………………………………….. 93

3-6. رنگ‌آمیزی XTT…………………………………………………………………………………………………………………………… 93

3-7. رنگ‌آمیزی تریپان بلو……………………………………………………………………………………………………………………. 95

3-8. شمارش سلولی………………………………………………………………………………………………………………………………. 95

3-9. تعیین درصد زنده ماندن سلول‌ها………………………………………………………………………………………………… 95

3-10. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی………………………………………………………. 96

3-10-1. آماده سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………. 96

3-10-2. روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………… 96

3-11. تعیین میزان هیدروژن پر اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی……………………………………………….. 97

3-11-1. آماده‌سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 97

3-11-2. منحنی استاندارد H₂O₂……………………………………………………………………………………………………….. 98

3-11-3. مخلوط واکنش………………………………………………………………………………………………………………………. 98

3-12. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 در نمونه لیز شده سلولی…………………………………………………… 98

3-12-1. مواد………………………………………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-2. آماده‌سازی محلول‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-3. آماده‌سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-4. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 100

3-13. حیوانات آزمایشگاهی انتخاب شده برای تحقیق…………………………………………………………………… 101

3-13-1. روش‌های نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………………………………………… 101

3-13-1-1. نیاز‌های محیطی موش کوچک آزمایشگاهی……………………………………………………………….. 101

3-13-1-2. بستر مناسب………………………………………………………………………………………………………………….. 103

3-13-1-3. رعایت اصول بهداشتی در نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………… 103

3-13-1-4. تغذیه……………………………………………………………………………………………………………………………… 104

3-14. اجرای الگوی زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 105

3-15. تیمار موضعی لیپو پلی ساکارید…………………………………………………………………………………………….. 107

3-16. آماده‌سازی لیزات بافت……………………………………………………………………………………………………………. 109

3-17. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی بافت لیز شده………………………………………………………. 110

3-17-1. آماده‌سازی نمونه‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 110

یکی از این گیاهان دارویی گیاه مرزه با نام علمی satureja hortensis L. می باشد  که در طب سنتی کاربردهای زیادی دارد. این گیاه متعلق به خانواده نعناع (lamiaceae) می باشد و شامل حدود 200 گونه از گیاهان، درختچه ها و گیاهان معطر عمدتاً با توزیع گسترده در منطقه ی مدیترانه، آسیا و آمریکای شمالی می باشد (72).

این گیاه غنی از اسانس است و در آن اجزاء و ترکیبات مختلفی وجود دارد و هر کدام از این ترکیبات دارای خواص متنوعی می باشند بسیاری از آنها بعنوان عامل طعم دهنده در غذا و بسیاری دیگر برای اهداف دارویی مورد استفاده قرار می گیرد.

 

همچنین این گیاه دارای خواص زیادی برای درمان بسیاری از بیماری هاست که میتوان به خاصیت ضدویروسی، ضدباکتریایی، ضدقارچی، ضددرد، ضدآرتریت، ضدسرطان، ضدالتهاب، ضدکرم، ضداکسیدان، ضداسپام، معرق، ضداسهال، هضم کننده غذا، خلط آور، مسکن درد دندان، محرک قوی معده، ضدعفونی کننده و… اشاره کرد (7).

از کارواکرول موجود در آن در تولید محصولات بهداشتی، بعنوان ضد عفونی و در اسپری ها خوشبو کننده و بعنوان دافع حشرات به طور گسترده استفاده می شود و همینطور در تهیه ی برخی اسانس های مصنوعی استفاده می شود (13).

در بخش گیاه شناسی از فصل دوم بطور کامل در مورد این گیاه و اثرات آن توضیح داده شده است.

یک مطلب دیگر :

دراین پژوهش جهت دستیابی به داروهای موثر علیه ویروس هرپس سیمپلکس تیپ یک برآن شدیم که با توجه به موارد استفاده فراوان ازعصاره دارویی گیاه مرزه در درمان بیماری های مختلف، فعالیت ضد ویروسی عصاره این گیاه را برعلیه هرپس سیمپلکس تیپ یک در کشت سلول انسانی مانند سلول Hela بررسی نماییم .

سلول  Helaاز سلول های سرطان دهانه رحم انسان به دست آمده، این سلول میزبان مناسبی برای ویروس فوق می باشد و اثرات سایتوپاتیک ناشی از تکثیر ویروس به خوبی در آن مشخص می شود.

اهداف تحقیق را می توان این گونه بیان کرد :

1-4-5- ژنتیک میوم ها……………………………………………………………………………………. 12

1-5- هموستاز…………………………………………………………………………………………………. 13

1-6- تشکیل فیبرین و سیستم فیبرینولایتیک……………………………………………………………. 15

1-7- هموستاز و سرطان…………………………………………………………………………………….. 18

1-8- ترومبوز و سرطان……………………………………………………………………………………… 20

1-9- ترومبین………………………………………………………………………………………………… 21

1-9-1- ارتباط پلی مورفیسم PT G20210A و خطر ابتلاء به سرطان و ترومبوز……….. 22

1-10- فیبرینوژن……………………………………………………………………………………………… 23

1-10-1- ارتباط پلی مورفیسم FGB-455G/A و خطر ابتلاء به سرطان و ترومبوز…….. 24

1-11- بازدارنده ی فعال كننده پلاسمینوژن1 (PAI-1)…………………………………………….. 25

1-11-1- ارتباط پلی مورفیسم PAI-1 (4G/5G)و خطر ابتلاء به سرطان و ترومبوز……. 27

1-12- اهدف …………………………………………………………………………………………………. 28

فصل دوم: مواد و روش ها

2-1- مقدمه……………………………………………………………………………………………………. 30

 

2-2- مواد و وسایل لازم جهت انجام آزمایشهای مولکولی ………………………………………… 31

2-3- استخراج DNA از خون…………………………………………………………………………… 33

2-4- بررسی کیفیت و کمیت ژنوم استخراج شده …………………………………………………….. 34

2-4-1- تعیین کیفیت و کمیت ژنوم با استفاده از دستگاه اسپكتروفتومتر نانودراپ …………. 34

2-4-2- تعیین میزان کیفیت ژنوم با استفاده از الکتروفورز ……………………………………….. 36

2-5- واكنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) ……………………………………………………………….. 37

 

2-5-1- مراحل PCR …………………………………………………………………………………… 37

2-6- روش تکثیر متزلزل جهش ها(ARMS-PCR)  …………………………………………….. 39

2-7- کنترل داخلی……………………………………………………………………………………………… 41

2-8- تهیه مخلوط PCR ………………………………………………………………………………….. 42

2-9- الكتروفورز……………………………………………………………………………………………… 46

2-9-1- الكتروفورز بر روی ژل آگارز………………………………………………………………… 46

2-9-2- مواد مورد نیاز برای الكتروفورز با ژل آگارز………………………………………………. 47

2-10- الكتروفورز ژل آگارز بر روی محصولات PCR مورد مطالعه …………………………… 48

2-11- عكس برداری از ژل………………………………………………………………………………… 49

2-12- آنالیز آماری داده ها…………………………………………………………………………………. 49

فصل سوم: نتایج

3-1- مقدمه …………………………………………………………………………………………………… 51

3-2- اطلاعات مربوط به بیماران میوم رحمی و افراد سالم…………………………………………. 52

3-3- بررسی یک عامل خطر در جمعیت مورد مطالعه ……………………………………………… 52

3-3-1- رابطه بین سن و خطر ابتلاء به میوم رحمی………………………………………………. 52

3-4-  بررسی پلی مورفیسم های مورد مطالعه و خطر ابتلاء به میوم رحمی …………………… 54

3-4-1-  بررسی پلی مورفیسم  G20210Aدر پروموتر ژن پروترومبین ………………….. 54

3-4-1-1- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم PT G20210A ………………………… 55

3-4-2-  بررسی پلی مورفیسم -455G/A  FGB………………………………………………. 58

3-4-2-1- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم -455G/A FGB ………………………. 59

3-4-3-  بررسی پلی مورفیسم PAI-1 (4G/5G) ……………………………………………… 62

3-4-3-1- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم PAI-1 (4G/5G) ……………………… 63

یک مطلب دیگر :

فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری

4-1- مقدمه …………………………………………………………………………………………………… 67

4-2- بحث …………………………………………………………………………………………………… 68

4-2-1- بررسی ارتباط بین سن و خطر ابتلاء به میوم رحمی……………………………………. 68

4-2-2- ارتباط پلی مورفیسم های مورد مطالعه و خطر ابتلاء به سرطان………………………. 68

4-2-2-1- ارتباط پلی مورفیسم PT G20210A و خطر ابتلاء به سرطان …………….. 68

4-2-2-2- ارتباط پلی مورفیسم FGB-455G/A و خطر ابتلاء به سرطان …………….. 69

4-2-2-3- ارتباط پلی مورفیسم  PAI-1 (4G/5G)و خطر ابتلاء به سرطان ………….. 70

4-2-3- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم های مورد مطالعه ………………………………… 71

4-2-3-1- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم PT G20210A ………………………… 71

4-2-3-2- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم FGB-455G/A ……………………….. 73

4-2-3-3- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم PAI-1-675 (4G/5G) ……………… 74

4-3- نتیجه گیری ……………………………………………………………………………………………. 76

4-4- پیشنهادات……………………………………………………………………………………………… 77

فهرست منابع و مأخذ ……………………………………………………………………………………….. 78

منابع فارسی ……………………………………………………………………………………………………. 78

منابع غیر فارسی…………………………………………………………………………………………………. 78

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………… 92

فهرست جداول

جدول2-1: مواد لازم جهت آزمایشهای مولکولی………………………………………………………… 31

جدول2-2: دستگاه و وسایل لازم جهت آزمایشهای مولکولی………………………………………… 32

جدول2-3: توالی آغازگرهای به کار رفته در روش ARMS-PCR………………………………. 40

جدول2-4: توالی آغازگرها، به منظور کنترل داخلی……………………………………………………… 41

جدول2-5: غلظت نهایی اجزای واکنش PCR به منظور تکثیر ژن  PT G20210A………… 43

جدول2-6: غلظت نهایی اجزای واکنش PCR به منظور تکثیر ژن FGB-455G/A…………. 43

جدول2-7: غلظت نهایی اجزای واکنش PCR به منظور تکثیر ژن (4G/5G)  PAI-1-675 44

جدول2-8: برنامه PCR جهت تكثیر ژن فاكتور II…………………………………………………….. 44

جدول2-9: برنامه PCR جهت تكثیر ژن β- فیبرینوژن……………………………………………….. 45

جدول2-10: برنامه PCR جهت تكثیر ژن PAI-1……………………………………………………. 45

جدول3-1: اطلاعات مربوط به بیماران میوم رحمی و افراد سالم…………………………………….. 52

جدول3-2: درصد فراوانی بیماری در گروه های مختلف سنی……………………………………….. 53

جدول3-3: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه G20210A PT و خطر ابتلاء به میوم رحمی….. 55

جدول3-4: تجزیه و تحلیل آللی و ژنوتیپی پلی مورفیسم G20210A PT ……………………. 56

جدول3-5: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه G20210A PT در دو گروه بیمار و شاهد…….. 57

جدول3-6: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه -455G/A FGB و خطر ابتلاء به میوم رحمی… 59

جدول3-7: تجزیه و تحلیل آللی و ژنوتیپی پلی مورفیسم FGB-455G/A …………………… 60

جدول3-8: توزیع ژنوتیپی وآللی در ناحیه -455G/A FGB در دو گروه بیمار و شاهد…….. 61

جدول3-9: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه 4G/5G ژن PAI-1 و خطر ابتلاء به میوم رحمی 63

جدول3-10: تجزیه و تحلیل آللی و ژنوتیپی پلی مورفیسم PAI-1-675 (4G/5G)  ……… 64

جدول3-11: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه 4G/5G ژن PAI-1 در دو گروه بیمار و شاهد 65

جدول4-1: توزیع آللی پلی مورفیسم PT G20210A در جمعیت های مختلف …………….. 72

1-3- باکتری های لاکتیکی ………………………………………………………………………………………………………………………….    11

1-3-1- نقش باکتری های اسید لاکتیک در صنایع غذایی ………………………………………………………………………..    13

1-3-2- متابولیسم باکتری های اسید لاکتیک ……………………………………………………………………………………………    14

1-3-2-1- باکتری های اسید لاکتیک هموفرمنتاتیو (همگن)…………………………………………………………………….    14

1-3-2-2- باکتری های اسید لاکتیک هتروفرمنتاتیو (ناهمگن)…………………………………………………………………   15  1-4- لاکتوباسیل ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………  17

1-5- طبقه بندی لاکتوباسیل ها……………………………………………………………………………………………………………………..  18

1-6- تاریخچه ی لاکتوباسیل ها …………………………………………………………………………………………………………………….  19

1-7- محصولات . ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..  20

1-7-1- پنیر ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………  20

1-7-1-1- انواع پنیر ………………………………………………………………………………………………………………………………………  20

1-7-1-2- ارزش غذایی پنیر………………………………………………………………………………………………………………………….   20

1-7-2- ماست ……………………………………………………………………………………………………………………………………………….   21

1-8- باکتریوفاژ ………………………………………………………………………………………………………………………………………………   22

1-8-1- نقش باکتریوفاژ در صنایع لبنی شیر ………………………………………………………………………………………………   24

1-8-1-2- منابع اصلی آلودگی فاژی در کارخانجات صنایع لبنی ……………………………………………………………….  24

1-8-3- اثر باکتریوفاژها …………………………………………………………………………………………………………………………………  24

1-8-4- تاریخچه کشف باکتریوفاژ ……………………………………………………………………………………………………………….  25

1-8-5- مورفولوژی باکتریوفاژ ها ………………………………………………………………………………………………………………… 26

1-8-6- طبقه بندی باکتریوفاژ ……………………………………………………………………………………………………………………..  28

1-8-7- مراحل ورود و تکثیر باکتریوفاژ ……………………………………………………………………………………………………….  30

1-8-7-1- مرحله جذب فاژ بر روی سلول باکتری ………………………………………………………………………………………  30

 

1-8-7-2- مرحله ورود فاژ به داخل باکتری ………………………………………………………………………………………………..  31

1-8-7-3- بیوسنتز ……………………………………………………………………………………………………………………………………….  31

1-8-7-4- رسیدگی کامل ……………………………………………………………………………………………………………………………  31

1-8-8- منشا فاژ …………………………………………………………………………………………………………………………………………..  32

1-8-9- سیکل حیاتی فاژ …………………………………………………………………………………………………………………………….  32

1-8-9-1- سیکل لیتیک    ………………………………………………………………………………………………………………………..  32

1-8-9-2- سیکل لیزوژنیک …………………………………………………………………………………………………………………………  32

1-8-10- روش جداسازی فاژ ………………………………………………………………………………………………………………………  34

1-8-10-1- روش مستقیم ………………………………………………………………………………………………………………………….  34

1-8-10-1-1-روش های میکروبیولوژی …………………………………………………………………………………………………….  34

1-8-10-1-2- روش مولکولی …………………………………………………………………………………………………………………….  34

1-8-10-2 روش غیر مستقیم سنتی ………………………………………………………………………………………………………….  35

1-8-10-2-1- تست فعالیت ………………………………………………………………………………………………………………………  35

1-8-10-2-2- تست اندیکاتور …………………………………………………………………………………………………………………..  35

1-8-10-2-3- فلوسایتومتری ……………………………………………………………………………………………………………………  35

1-8-10-2-4- امپدانس الکتریکی یا رسانایی شیر …………………………………………………………………………………..  35

1-8-10-2-5- سنجش پلاک – لکه و رشد – توربیدومتری …………………………………………………………………….  36

1-8-10-2-6- انواع PCR  …………………………………………………………………………………………………………………………  37

1-8-10-2-6-1- …..Mutiplex PCR……………………………………………………………………………………………………….  37

1-8-10-2-6-2- Quntitive PCR………………………………………………………………………………………………………….  37

1-8-10-2-6-3- Traditional PCR  …………………………………………………………………………………………………….  38

1-8-11- کنترل فاژ …………………………………………………………………………………………………………………………………….  38

1-9- مقاومت انتی بیوتیک ………………………………………………………………………………………………………………………….  40

1-9-1- مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل های پروبیوتیک ……………………………………………………………………..  42

1-9-2- انواع مقاومت  آنتی بیوتیک …………………………………………………………………………………………………………..  43

1-9-3- انتقال ژن های افقی لاکتوباسیل های پروبیوتیک ……………………………………………………………………….. 43

1-9-4- عوام ضد باکتریایی………………………………………………………………………………………………………………………….. 43

1-9-4-1- آنتی بیوتیک ها………………………………………………………………………………………………………………………….. 45

1-9-5- مکانیسم آنتی بیوتیک ها ………………………………………………………………………………………………………………  45

1-9-5-1- آنتی بیوتیک ها ی ممانعت کننده از سنتز دیواره سلول…………………………………………………………   47

1-9-5-1-1- آنتی بیوتیک های بتالاکتام …………………………………………………………………………………………………  48

1-9-5-2- مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک بتالاکتام …………………………………………………………………………………  48

1-9-5-2-1- پنی سیلین ها ……………………………………………………………………………………………………………………..  49

1-9-5-2-2- سفالوسپورین ها و سفامایسین ها ………………………………………………………………………………………..  50

1-9-5-2-3- گلیکوپپتیدها ………………………………………………………………………………………………………………………..  51

1-9-5-2-4- پلی پپتید ها ………………………………………………………………………………………………………………………..  51

1-9-5-2-5- ایزونیازید، اتیونامید، اتامبتول و سیکلوسرین ……………………………………………………………………… 52

1-9-5-3- انتی بیوتیک های مهار کننده سنتز پروتئین ………………………………………………………………………….. 52

یک مطلب دیگر :

1-9-5-3-1- آمینوگلیکوزید ها …………………………………………………………………………………………………………………  52

1-9-5-3-2- تتراسایکلین ……………………………………………………………………………………………………………………….   54

1-9-5-3-2-1- مقاومت به تتراسایکلین …………………………………………………………………………………………………   54

1-9-5-3-3- اگزازولیدین ………………………………………………………………………………………………………………………..   54

1-9-5-3-4- کلرامفنیکل …………………………………………………………………………………………………………………………  55

1-9-5-3-5- ماکرولیدها …………………………………………………………………………………………………………………………..  55

1-9-5-3-5-1- مقاومت به ماکرولید ها ………………………………………………………………………………………………….  55

1-9-3-6- کلیندامایسین …………………………………………………………………………………………………………………………. 56

1-9-3-7- استرپتوگرامین ………………………………………………………………………………………………………………………  56

1-9-5-4- آنتی بیوتیک های مهار کننده اسید نوکلوئیک ………………………………………………………………………. 57

1-9-5-4-1- کینولون ها ………………………………………………………………………………………………………………………….  57

1-9-5-4-2- ریفامپین و ریفابوتین ………………………………………………………………………………………………………..   57

1-9-5-4-3- مترانیدازول ………………………………………………………………………………………………………………………..   58

1-9-5-4-4- آنتی متابولیت ها ………………………………………………………………………………………………………………..  58

1-9-6-1- اهمیت مقاومت آنتی بیوتیک ها در دام …………………………………………………………………………………  59

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1- تاریخچه …………………………………………………………………………………………………………………………………………..  62

2-2- مطالعات انجام شده در باکتریوفاژ …………………………………………………………………………………………………..  62

2-3- مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها …………………………………………………………………………………………….  64

فصل سوم: مواد و روش کار

3-1- دستگاه های مورد نیاز ……………………………………………………………………………………………………………………..  68

3-2- لوازم مورد نیاز …………………………………………………………………………………………………………………………………..  69

3-3- مواد مورد نیاز …………………………………………………………………………………………………………………………………….  69

3-4- سویه های میکروبی مورد مطالعه ……………………………………………………………………………………………………… 71

3-4-2- آماده سازی محیط های کشت ……………………………………………………………………………………………………..  71

3-4-2-1- محیط های کشت MRS  آگار ………………………………………………………………………………………………..  72

3-4-2-2- محیط های کشت نرم MRS  آگار …………………………………………………………………………………………  72

3-4-2-3- محیط کشت MRS  مایع ……………………………………………………………………………………………………….  72

3-5- کشت و آزمایشات تعین هویت باکتری  …………………………………………………………………………………………..  72

3-6- سنجش فاژ ………………………………………………………………………………………………………………………………………..  73

3-6-1- روش دو لایه ای پلاک …………………………………………………………………………………………………………………  73

3-6-2- مشاهده پلاک توسط القاء با پرتو UV ……………………………………………………………………………………….  73

3-6-3- آزمون Heap and Lawrence …………………………………………………………………………………………………  74

3-7- سنجش حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک ………………………………………………………………………………………  75

3-7-2- آزمایش تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش انتشار دیسک در آگار ( دیسک دیفیوژن) …..  76

3-7-2-1- روش انجام آزمایش دیسک گذاری ………………………………………………………………………………………   76

3-7-2-1-1- تهیه محیط کشت ……………………………………………………………………………………………………………   76

3-7-2-1-2- روش کار …………………………………………………………………………………………………………………………..  77

فصل چهارم : نتایج

4-1- شرح مختصری از مطالعه ……………………………………………………………………………………………………………….  80

4-2- نتایج ………………………………………………………………………………………………………………………………………………..  80

4-2-1- نتایج حضور یا عدم حضور فاژ در سویه ها …………………………………………………………………………………  81

4-2-2- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء  UV و میتومایسین C  ………………………………………….  83

4-2-3- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء با میتومایسین C و Heap and Lawrence  ………….. 83

4-2-4- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء با پرتو UV و Heap and Lawrence ……………………  84

4-3- نتایج حساسیت ومقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها …………………………………………………………………. 84

4-4- نتایج میزان درصد حساسیت و مقاومت سویه ها به آنتی بیوتیک …………………………………………………  91

4-5-1- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به آمینوگلیکوزید ها   92

4-5-2- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به سفالوسپورین ها ..  92

4-5-3- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به گلیکوپپتیدها …….  93

4-5-4- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به لینکوزامید ها …….  93

4-5-5- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به ماکرولیدها …………  94

4-5-6- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به پنی سیلین ها …..  94

4-5-7- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به کینولون ها ………..  95

4-5-8- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به سولفانامید ها ………  95

4-5-9- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به تتراسایکلین ها…….. 96

4-5-10- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به دیگر آنتی بیوتیک‌ها………………  96

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری  

5-1- اهمیت جداسازی فاژ ……………………………………………………………………………………………………………………….   99

2-7-1.  تشخیص آزمایشگاهی بیماری………………………………………..29

-7-2.  انواع تست هاى سرولوژیك بروسلوز………………………………….33

2-7-2-1 تست آگلوتیناسیون داخل لوله ای استاندارد………………………………………33

2-7-2-2  تست آگلوتیناسیون ME2……………………………………………………….33

2-7-2-3. تست آنتی گلوبولین یا كمبس رایت………………………………………………34

2-7-2-4. تست فیكساسیون كمپلمان ( ثبوت مکمل )………………………………………34

2-7-2-5و6. تست های رادیوایمونواسی و ELISA…………………………………….34

2-7-2-7. تست رزبنگال………………………………………………………………….34

2-7-3. تشخیص بروسلوزیس بر اساس روش های مولکولی………….34

2-8. آنتی ژن های سطحی……………………………………………..35

2-8-1. لیپوپلی ساکارید(LPS  )…………………………………………35

2-8-2. پروتئین غشاء خارجی(OMP)………………………………….38

2-8-3. پورین های عمومی………………………………………………….41

2-9.  واکسن های بروسلوز………………………………………………42

2-9-1. واكسن های كونژوگه و طراحی آن ها……………………………………….49

2-9-1-2. انتخاب پروتئین حامل…………………………………………..50

2-9-1-1.  انتخاب پلی ساكارید…………………………………………………………..50

 

2-9-1-3.  نسبت پلی ساکارید به پروتئین………………………………….51

2-9-1-4. تهیه ی کونژوگه های ایمونوژن هاپتن–حامل…………………….51

2-9-1-5. پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیکی..52

2-9-1-6. ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه………………..53

2-9-1-7. جفت شدگی شیمیایی ( اتصال) ……………………………………53

2-9-1-8. EDC یا EDAC …………………………………….54

2-9-1-9. آدپیک اسید دی هیدرازید …………………………………………55

2-9-1-10. كونژوگاسیون به شیوه آمیداسیون………………………………56

3-1. تهیه میکروارگانیسم مورد نظر……………………………………….58

3-2. باز کردن سوش لیوفریزه بروسلا آبورتوس……………………..58

3-3. کنترل سوش لیوفیلیزه از نظرRough و Smooth بودن……..59

3-4. تهیه بیوماس سلولی………………………………………………….60

3-5. استخراج و تخلیص LPS بروسلا آبورتوس S99……………….61

3-5-1. د تو کسیفیه کردن LPS با روش قلیایی…………………………..63

3-5-2. آزمون Novotny…………………………………………………..63

3-6. استخراج و خالص سازی Omp بروسلا آبورتوس RB51……………64

3-6-2. اندازه‌گیری پروتئین با روش لوری…………………………………..65

3-7. کونژوگاسیون Omp و LPS بروسلا آبورتوس………………………..68

3-8. ستون کروماتوگرافی برای تخلیص کونژوگه………………………..69

3-8-1. مراحل پک کردن ستون کروماتوگرافی……………………….69

یک مطلب دیگر :

3-9. آزمون کنترل کیفی کونژوگه………………………………………71

3-9-1. کنترل تب زایی در خرگوش(in vivo test)……………………71

3-9-2. کنترل توکسیسیته غیر عادی(Abnormal Toxicity)………..72

3-10. واکسیناسیون  و سنجش ایمنی زایی کونژوگه……………………..72

3-11. آزمون بررسی فعالیت باکتری کشی سرم حیوان(سرم باکتریسیدال اسیSBA)……..73

3-11-1. اصول آزمون SBA……………………………………………74

4-1. تعیین میزان LPS خام در نمونه استخراج شده با آزمون نووتنی……77

4-2. تعیین غلظت پروتئین در نمونه Omp بروسلا آبورتوس RB51 به روش لوری………….80

4-3. نتایج کنترل کیفی کونژوگه……………………………………….81

4-6. نتایج بررسی کنترل توکسیسیته غیر عادی(Abnormal toxicity)..82

4-5. نتایج کنترل تب زایی در خرگوش (in vivo test)………………..82

4-7. ارزیابی فعالیت باکتری کشی سرم باکتریوسیدال اسی(SBA)…………..83

فهرست شکل ها

شکل(2-1)- عفونت دریچه قلب توسط B.abortus ……………….12

شکل(2-2)بروسلا آبورتوس دارای منشاء گاوی…………………………………………..21

شکل(2-3) بروسلا سوئیس دارای منشاء خوک……………………………………………..22

شکل(2-4) بروسلا سوئیس دارای منشاء موش صحرایی………………………………….23

شکل(2-5) بروسلا سوئیس دارای منشاء پستانداران دریایی……………………………….24

شکل(3-1) کنترل سوش RB51 با استفاده از اکروفلاوین………………………………..60

شکل (3-2)کشت و درو بروسلا…………………………………………………………….61

شکل(3-3):استخراج LPS به روش فنول داغ اصلاح شده……………………………..62

شکل(3-4) کیسه دیالیز کونژوگه Omp+ LPS…………………………………………69

شکل(3-5): عبور کونژوگه از ستون کروماتوگرافی………………………………..71

فهرست نمودارها و جدول ها

جدول(4-1). تغییرات جذب نوری برحسب غلظت LPS استاندارد……………………78

نمودار(4-1): نمودار استاندارد غلظت LPS………………………………………………79

جدول(4-2). تغییرات جذب نوری برحسب غلظت Omp به روش لوری………………80

نمودار(4-2). نمودار استاندارد لوری……………………………………………………81

نمودار(4-3).کروماتو گرافی کونژوگه و فراکشن های آن……………………………..82

جدول(4-3): نتایج گشت رقت های مختلف سرم خرگوش تزریق شده با واکسن کونژوگه و واکسن زنده…….85

 

چکیده