فهرست مطالب
فصل اول: مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………………………..1
1-1 مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………1
فصل دوم: بررسی منابع………………………………………………………………………………………………………………………..5
2-1 نخود و اهمیت آن……………………………………………………………………………………………………………………………..5
2-2 تنشهای مؤثر بر عملکرد نخود زراعی……………………………………………………………………………………………..6
2-2-1 تنشهای زیستی …………………………………………………………………………………………………………..6
2-2-2 تنشهای غیر زیستی…………………………………………………………………………………………………….7
2-3 پدیده بروز خشکی در کشور…………………………………………………………………………………………………………….8
2-3-1 اثرات تنش خشکی ……………………………………………………………………………………………………….8
2-4 نشانگرهای مورفولوژیکی………………………………………………………………………………………………………………….9
2-5 نشانگرهای بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………………………………………..10
2-6 نشانگرهای مولکولی…………………………………………………………………………………………………………………………11
2-7 توالیهای تکرار شونده…………………………………………………………………………………………………………………….13
2-7-1 توالیهای تکراری ساده (SSR) یا ریزماهوارهها……………………………………………………………14
2-7-1-1 کاربرد نشانگرهای ریز ماهواره در گیاهان……………………………………………………..15
2-8 نشانگر مولکولی ISSR……………………………………………………………………………………………………………………17
2-8-1 منشأ تغییرات چند شکلی در نشانگر ISSR…………………………………………………………………………….19
2-8-1-1 DNA الگو…………………………………………………………………………………………………………….19
2-8-1-2 ماهیت آغازگر مورد استفاده………………………………………………………………………………….20
2-8-2 روش شناسایی…………………………………………………………………………………………………………………………..22
2-8-3 مزایای ISSR…………………………………………………………………………………………………………………………….22
2-8-4 معایب ISSR ……………………………………………………………………………………………………………………………23
2-8-5 کاربردهای نشانگر ISSR………………………………………………………………………………………………………….23
2-8-5-1 تهیه نقشه ژنتیکی…………………………………………………………………………………………………23
2-8-5-2 گزینش به کمک نشانگر………………………………………………………………………………………..24
2-8-5-3 انگشت نگاری ژنوم………………………………………………………………………………………………..24
2-8-5-4 تعیین فراوانی موتیفهای SSR ………………………………………………………………………….25
2-8-5-5 مطالعه روی جمعیتهای طبیعی و گونهزایی……………………………………………………..25
2-8-5-6 تعیین تنوع ژنتیکی……………………………………………………………………………………………..26
فصل سوم: مواد و روش………………………………………………………………………………………………………………….32
3-1 مواد گیاهی……………………………………………………………………………………………………………………………….32
3-2 استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………………………33
3-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA ژنومی استخراج شده………………………………………………………………35
3-3-1 الکتروفورز ژل آگارز……………………………………………………………………………………………….35
3-3-2 روش نانو دراپ………………………………………………………………………………………………………36
3-4 انجام واکنش PCR………………………………………………………………………………………………………………….36
3-4-1 آغازگرهای ISSR…………………………………………………………………………………………………37
3-4-2 برنامه حرارتی چرخههای PCR…………………………………………………………………………..38
3-5 الکتروفورز محصولات PCR…………………………………………………………………………………………………..39
3-6 تشخیص باند اختصاصی و تعیین توالی آن……………………………………………………………………………40
فصل چهارم: نتایج و بحث………………………………………………………………………………………………………….41
4-1 استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………………….41
4-2 PCR با 13 آغازگر با استفاده از مخلوط DNA ژنوتیپهای متحمل و ژنوتیپهای حساس گیاه نخود…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 44
4-3 تعیین بهترین آغازگر(ها) برای تکثیر قطعات ISSR در هشت ژنوتیپ نخود به صورت جداگانه
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………46
4-4 جداسازی، تعیین توالی و انجام همردیفی باندهای متمایز تکثیر شده……………………………….49
فصل پنجم: نتیجه گیری کلی و پیشنهادات…………………………………………………………………………54
پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………..55
فهرست شکلها
عنوان صفحه |
شکل 2-1. انواع نشانگرها………………………………………………………………………………………………13
شکل 2-2. نمایش اتصال آغازگر (AG)8 به DNA……………………………………………………………..21
شکل 3-1. گیاهان حاصل از بذرهای کشت شده ژنوتیپهای مختلف در مزرعه پژوهشکده علوم گیاهی..………………………………………………………………………………………………………………………..33
شکل 4-1. نمونههای DNA بر روی ژل آگارز 1 درصد با روش .CTAB…………………………………42
شکل 4-2. سنجش کیفیت و کمیت یکی از نمونه های استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ ……………………………………………………………………………………………………………………………………43
شکل 4-3. مقایسه محصول PCR با نمونههای DNA استخراج شده با روش کیت و CTAB ……………………………………………………………………………………………………………………………………44
شکل 4-4. الکتروفورز ژل آگارز PCR با مخلوط DNA ژنوتیپهای حساس و متحمل………….45
شکل 4-5. الکتروفورز ژل آگارز PCR با 8 ژنوتیپ گیاه نخود با آغازگرهای نشانگر ISSR…..47
شکل 4-6. PCR با 8 ژنوتیپ گیاه نخود با آغازگرهای نشانگر ISSR…………………………………48
شکل 4-7. PCR با 8 زنوتیپ گیاه نخود توسط آغازگرهای ISSR………………………………………49
شکل 4-8. همردیفی انجام شده توسط الگوریتم BLAST در پایگاه Gene Bank از طریق وبگاه NCBI……………………………………………………………………………………………………………………………50
|
فهرست جدولها
عنوان صفحه |
جدول 2-1. اسامی مترادف ISSR و تغییرات آن……………………………………………………………..19
جدول 3-1. تهیه بافر استخراج……………………………………………………………………………………..35
جدول 3-2. ترکیبات و اجزای مورد استفاده جهت انجام واکنش PCR…………………………….37
جدول 3-3. مشخصات آغازگرهای مورد استفاده جهت تکثیر توالی DNA………………………38
جدول 3-4. برنامه زمان بندی چرخه حرارتی برای تکثیر آغازگرهای ISSR…………………….39
|
فصل اول
مقدمه
نخود (Cicer arietinum L.) با 2n=2x=16 کروموزوم و ژنومی به اندازه Mbp750 یکی از مهمترین نوع حبوبات در کشورهای در حال توسعه بوده و همچنین حائز رتبه سوم در بین تمامی حبوبات است (فائو[1]، 2012). نخود یکی از مهمترین محصولات حبوبات در هند و کشورهای مجاور آن است که 90% تولید جهانی را به خود اختصاص داده است (گوپتا و همکاران، 2011). به طور کلی، نخود زراعی در میان کلیه محصولات دانهای جهان، رتبه پانزدهم را به خود اختصاص داده است (گائور و همکاران، 2007). این گیاه در دامنه وسیعی از شرایط آب و هوایی، از نواحی نیمه گرمسیری شبه قاره هند و استرالیا تا مناطق مدیترانهای حوزه مدیترانه، غرب آسیا، شمال آفریقا، جنوب و جنوب غربی اروپا کشت میشود (سیدیک و همکاران، 2000). علاوه بر اهمیت این گیاه به عنوان یك منبع مهم برای تغذیه انسان و دام، در مدیریت حاصلخیزی خاك به ویژه در
یک مطلب دیگر :
بهبود خوشه بندی شبکه های حسگر بیسیم با بهره گرفتن از ترکیب الگوریتم ژنتیک و کلونی مورچگان - دانلود پایان نامه های ارشد
مناطق خشك نیز میتواند بسیار مؤثر باشد (کلارک و همکاران، 2004؛ وارشنی و همکاران، 2009). بذر نخود حاوی 20 تا 30% پروتئین، 40% کربوهیدرات و فقط 3 تا 6% روغن است. همچنین، سرشار از عناصر معدنی نظیر Ca، Mg، K، S، Fe، Mn وZn میباشد. تولید کارتنوئیدهای سودمندی مانند بتاکاروتن و همین طور قابلیت تثبیت نیتروژن از دلایل دیگر اهمیت این گیاه به شمار میآید (میلان و همکاران، 2006). نخود از نظر مقدار پروتئین بسیار غنی بوده و از این لحاظ، برای افراد گیاهخوار و آنهایی که قدرت خرید گوشت را ندارند نقش مهمی در تأمین پروتئین رژیم غذایی ایفا مینماید. این گیاه به دلیل تثبیت نیتروژن اتمسفر در کاهش مصرف کود نیتروژنه نقش بسزایی بر عهده دارد. توانایی رشد و محصولدهی نخود در مناطق و شرایط مختلف آب و هوایی حکایت از پتانسیل بالا در این گیاه دارد. با این حال شرایط نامساعد محیطی نظیر خشکی و درجه حرارت بالا در طول دوره رشد به مقدار قابل ملاحظهای از عملکرد آن میکاهد (کوپر، 1998).
تنش خشکی بیشترین تأثیر را در کاهش عملکرد گیاهان دارد. این تنش سبب ایجاد اثرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی متعددی در گیاهان میگردد. بیشتر فرآیندهای فیزیولوژیکی وابسته به رشد محصولات زراعی متأثراز کمبود آب یا خشکی است که در مطالعات جهانی، خشکی به همراه دمای زیاد و تابش آفتاب از مهمترین عوامل محدود کننده غیر زیستی محصولات زراعی در جهان است (آراس و همکاران، 2002؛ بویر، 1982). به طور کلی خشکی به دو دسته متناوب و انتهای فصل تقسیم میشود. در طول خشکی انتهای فصل، آب قابل دسترس گیاه کاهش مییابد و به طور سریع منجر به خشکی میشود و رشد محصولات زراعی کاهش مییابد ولی خشکی متناوب در نتیجه باران ناکافی یا آبیاری ناکافی اتفاق میافتد که لزوما کشنده نیست. بررسیها نشان داده است که از بین تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی، تنش خشکی به تنهایی علت کاهش 50 درصد عملکرد نخود است (آنبسا و بجیگا، 2002؛ سکسینا، 2003). همچنین به این علت که نخود زراعی، اغلب در مناطق خشک و نیمه خشک، تحت شرایط دیم کشت میگردد و از آن جایی که تقریبا 90% محصول جهانی آن، در شرایط دیم تولید میشود، بنابراین تنش خشکی مهمترین عامل محدود کننده آن به شمار میرود (میلان و همکاران، 2006).
کشاورزی در اکثر مناطق جهان با استفاده زیاد آب همراه است که با افزایش روز افزون جمعیت و افزایش خشکسالیهای مکرر میزان آب در دسترس برای تولیدات کشاورزی در حال کاهش است. لذا خشکی به عنوان یکی از تنشهای محیطی محدود کننده عملکرد محصولات زراعی مطرح میباشد که یکی از راههای مطمئن بر فائق آمدن بر این مشکل اصلاح برای تحمل به تنش خشکی است. در عین حال واریتههای زودرس نخود با قابلیت فرار از خشکی انتهای فصل توسعه یافتهاند، اما بلوغ زودرس روی سقف عملکرد محصول اثر میگذارد و توانایی محصول زراعی برای بهره برداری از دوره رشد را کاهش میدهد (جانسون و همکاران، 1997).
نشانگرهای مولکولیDNA[2] به طور وسیع در بررسی تنوع ژنتیکی حاصل از موتاسیونها یا اشتباهات در همانندسازی DNA و یا تفاوتهای ذاتی و فردی مورد استفاده قرار میگیرند و بر خلاف نشانگرهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی، تحت تأثیر محیط قرار نگرفته و از لحاظ تعداد نامحدود و در تمام مراحل رشد گیاه قابل استفاده بوده و تغییری نمیکنند. علاوه بر کاربرد آنها در تهیه نقشه ژنتیکی، در اصلاح نباتات برای تشخیص تنوع ژرم پلاسم و محصولات زراعی بکار میروند. نشانگرهای مولکولی یکی از بهترین راهها برای بررسی تنوع ژنتیکی و زیستی در میان گونهها بوده و به دلیل دارا بودن ویژگیهایی چون تشخیص آسان افراد هتروزیگوت و هموزیگوت، نداشتن اپیستازی، قابلیت وراثت، تشخیص در مراحل مختلف حیات گیاه، عدم محدودیت به مواد بیولوژی، دقت بسیار بالا و آسان بودن اندازهگیری، در سالهای اخیر در امور اصلاح گیاهان زراعی بسیار رایج شده است (ملشینگر، 1990؛ میلان و همکاران، 2006).
گذشته از بروز دورههای خشکسالی و کاهش بارندگیها طی سالیان اخیر، تغییرات اقلیمی ناشی از اثرات گلخانهای، تشدید پدیده خشکی را در پی داشته است که به عنوان چالشی اساسی برای عملکرد و تولید گیاهان زراعی مطرح میباشد. قسمت اعظم وقوع و شدت تنش خشکی خارج از کنترل است و تنها مسیر مطمئن برای کاهش پیامدهای آن تولید گیاهان متحمل و یا ایجاد صفات دیگری چون فرار از خشکی است. بررسیهای انجام شده توسط متخصصان اصلاح نباتات و زیست شناسان مولکولی حاکی از آن است که پاسخ گیاهان به تنشهای محیطی (غیر زیستی) عموماً بصورت چند ژنی و در قالب اثرات افزایشی و غیر افزایشی ژنها کنترل میشود (پنجابی- سابهاروال و همکاران، 2009). بدلیل طبیعت متغیر تنشها و حساسیت فنوتیپ گیاه و نیز مشکلات انتقال صفت تحمل به تنش در ژنوتیپهای منتخب، روشهای سنتی اصلاح نباتات با موانع جدی روبرو است. لذا ترکیبی از شیوههای جدید مولکولی نظیر گزینش بوسیله نشانگرهای DNA وQTL[3] میتواند تسریع این فرآیندها را در پی داشته باشد (رن و همکاران، 2005). بنابراین در تحقیق حاضر از ژنوتیپهای متحمل و حساس استفاده شد که در گذشته مطالعات اولیه فیزیولوژیکی تنش خشکی در دانشگاه فردوسی مشهد بر روی آنها انجام شده است. ضمناً نشانگر مورد استفاده در این تحقیق ISSR[4] بود که به دلیل داشتن آغازگرهایی با طول 16 تا 25 جفت باز از طول بیشتری نسبت به آغازگرهایی مانند RAPD[5] (10 جفت باز) برخوردار بوده و بنابراین امکان تکرار پذیری آنها بالاتر بود.
در این تحقیق برای بررسی تفاوت احتمالی بین ژنوتیپهای متحمل و حساس از 13 آغازگر استفاده شد. هدف از این کار سهولت تشخیص تحمل به تنش خشکی با کمک نشانگرهای مولکولی و همچنین کسب اطمینان بیشتر نسبت به روش تشخیص فیزیولوژیک بود. نشانگرهای مولکولی در این تحقیق به عنوان راهی برای تشخیص تحمل به تنش خشکی فارغ از شرایط محیطی تأثیرگذار بکار برده میشوند.
فصل دوم
بررسی منابع
2-1- نخود و اهمیت آن
در حال حاضر حبوبات یکی از مهمترین منابع پروتئینی در رژیم غذایی بسیاری از مردم کشورهای در حال توسعه است. رژیم غذایی در این کشورها عمدتاً نشاسته است که از گیاهانی مثل برنج، گندم، ذرت، ارزن و گیاهان غدهای مثل سیب زمینی بدست میآید. آنچه مسلم است مقدار پروتئین در این محصولات کم بوده و سوء تغذیه میلیونها انسان ساکن در این کشورها یکی از مشکلات حاد این مناطق میباشد. لذا در این مناطق مصرف پروتئینهای گیاهی نظیر حبوبات که سرشار از پروتئین هستند، اهمیت قابل توجهی دارد (باقری و همکاران، 1379). نخود (Cicer arietinum L.)از جمله حبوبات و یکی از قدیمیترین گیاهان زراعی است که توسط بشر کشت شده است. نخود عمدتاً در جیره غذایی انسان به خصوص در برنامه غذایی طبقات کم درآمد جامعه نقش اساسی داشته و در مقایسه با غلات از تولید پروتئین قابل توجهی در واحد سطح برخوردار است (باقری و همکاران، 1379). به احتمال زیاد نخود از نواحی جنوب شرقی ترکیه و مناطق مجاور آن در سوریه منشأ گرفته است (سینگ، 1997).
تنشهای مختلفی باعث کاهش عملکرد در نخود میشود. این تنشها به دو گروه زیستی و غیر زیستی قابل تقسیم میباشند. هرچند نخود گیاهی مقاوم به خشکی است و دمای پایین را نیز تا حدی به خوبی تحمل میکند ولی دمای مطلوب رشد آن بین 20 تا 30 درجه سانتیگراد است. این گیاه در زمان گلدهی به گرما و تنش خشکی حساس میباشد که این دو عامل بیشترین تأثیر را در کاهش محصول در کشتهای بهاره و دیم اعمال میکنند (باقری و همکاران، 1386).