فهرست مطالب

فصل اول: مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………………………..1

1-1 مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………1

فصل دوم: بررسی منابع………………………………………………………………………………………………………………………..5

2-1 نخود و اهمیت آن……………………………………………………………………………………………………………………………..5

2-2 تنش­های مؤثر بر عملکرد نخود زراعی……………………………………………………………………………………………..6

2-2-1 تنش­های زیستی …………………………………………………………………………………………………………..6

2-2-2 تنش­های غیر زیستی…………………………………………………………………………………………………….7

2-3 پدیده بروز خشکی در کشور…………………………………………………………………………………………………………….8

2-3-1 اثرات تنش خشکی ……………………………………………………………………………………………………….8

2-4 نشانگرهای مورفولوژیکی………………………………………………………………………………………………………………….9

2-5 نشانگرهای بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………………………………………..10

2-6 نشانگرهای مولکولی…………………………………………………………………………………………………………………………11

2-7 توالی­های تکرار شونده…………………………………………………………………………………………………………………….13

2-7-1 توالی­های تکراری ساده (SSR) یا ریزماهواره­ها……………………………………………………………14

2-7-1-1 کاربرد نشانگرهای ریز ماهواره در گیاهان……………………………………………………..15

2-8 نشانگر مولکولی ISSR……………………………………………………………………………………………………………………17

2-8-1 منشأ تغییرات چند شکلی در نشانگر ISSR…………………………………………………………………………….19

2-8-1-1 DNA الگو…………………………………………………………………………………………………………….19

2-8-1-2 ماهیت آغازگر مورد استفاده………………………………………………………………………………….20

2-8-2 روش شناسایی…………………………………………………………………………………………………………………………..22

2-8-3 مزایای ISSR…………………………………………………………………………………………………………………………….22

2-8-4 معایب ISSR ……………………………………………………………………………………………………………………………23

2-8-5 کاربردهای نشانگر ISSR………………………………………………………………………………………………………….23

2-8-5-1 تهیه نقشه ژنتیکی…………………………………………………………………………………………………23

2-8-5-2 گزینش به کمک نشانگر………………………………………………………………………………………..24

2-8-5-3 انگشت نگاری ژنوم………………………………………………………………………………………………..24

2-8-5-4 تعیین فراوانی موتیف­های SSR ………………………………………………………………………….25

2-8-5-5 مطالعه روی جمعیت­های طبیعی و گونه­زایی……………………………………………………..25

2-8-5-6 تعیین تنوع ژنتیکی……………………………………………………………………………………………..26

فصل سوم: مواد و روش………………………………………………………………………………………………………………….32

3-1 مواد گیاهی……………………………………………………………………………………………………………………………….32

3-2 استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………………………33

3-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA ژنومی استخراج شده………………………………………………………………35

3-3-1 الکتروفورز ژل آگارز……………………………………………………………………………………………….35

3-3-2 روش نانو دراپ………………………………………………………………………………………………………36

3-4 انجام واکنش PCR………………………………………………………………………………………………………………….36

3-4-1 آغازگرهای ISSR…………………………………………………………………………………………………37

3-4-2 برنامه حرارتی چرخه­های PCR…………………………………………………………………………..38

3-5 الکتروفورز محصولات PCR…………………………………………………………………………………………………..39

3-6 تشخیص باند اختصاصی و تعیین توالی آن……………………………………………………………………………40

فصل چهارم: نتایج و بحث………………………………………………………………………………………………………….41

4-1 استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………………….41

4-2 PCR با 13 آغازگر با استفاده از مخلوط DNA ژنوتیپ­های متحمل و ژنوتیپ­های حساس گیاه نخود…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 44

4-3 تعیین بهترین آغازگر(ها) برای تکثیر قطعات ISSR در هشت ژنوتیپ­ نخود به صورت جداگانه

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………46

4-4 جداسازی، تعیین توالی و انجام همردیفی باندهای متمایز تکثیر شده……………………………….49

فصل پنجم: نتیجه گیری کلی و پیشنهادات…………………………………………………………………………54

پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………..55

فهرست شکل­ها

 

عنوان                                                                                                             صفحه

شکل 2-1. انواع نشانگرها………………………………………………………………………………………………13  شکل 2-2. نمایش اتصال آغازگر (AG)8 به DNA……………………………………………………………..21 شکل 3-1. گیاهان حاصل از بذرهای کشت شده ژنوتیپ­های مختلف در مزرعه پژوهشکده علوم گیاهی..………………………………………………………………………………………………………………………..33 شکل 4-1. نمونه­های DNA بر روی ژل آگارز 1 درصد با روش .CTAB…………………………………42 شکل 4-2. سنجش کیفیت و کمیت یکی از نمونه های استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ ……………………………………………………………………………………………………………………………………43 شکل 4-3. مقایسه محصول PCR با نمونه­های DNA استخراج شده با روش کیت و CTAB ……………………………………………………………………………………………………………………………………44 شکل 4-4. الکتروفورز ژل آگارز PCR با مخلوط DNA ژنوتیپ­های حساس و متحمل………….45 شکل 4-5. الکتروفورز ژل آگارز PCR با 8 ژنوتیپ گیاه نخود با آغازگرهای نشانگر ISSR…..47 شکل 4-6. PCR با 8 ژنوتیپ گیاه نخود با آغازگرهای نشانگر ISSR…………………………………48 شکل 4-7. PCR با 8 زنوتیپ گیاه نخود توسط آغازگرهای ISSR………………………………………49 شکل 4-8. همردیفی انجام شده توسط الگوریتم BLAST در پایگاه Gene Bank از طریق وبگاه NCBI……………………………………………………………………………………………………………………………50

 

 

 

فهرست جدول­ها

عنوان                                                                                                                     صفحه

جدول 2-1. اسامی مترادف ISSR و تغییرات آن……………………………………………………………..19  جدول 3-1. تهیه بافر استخراج……………………………………………………………………………………..35 جدول 3-2. ترکیبات و اجزای مورد استفاده جهت انجام واکنش PCR…………………………….37 جدول 3-3. مشخصات آغازگرهای مورد استفاده جهت تکثیر توالی DNA………………………38 جدول 3-4. برنامه زمان بندی چرخه حرارتی برای تکثیر آغازگرهای ISSR…………………….39

 

فصل اول

 

 

 

مقدمه

نخود (Cicer arietinum L.) با 2n=2x=16 کروموزوم و ژنومی به اندازه Mbp750 یکی از مهمترین نوع حبوبات در کشورهای در حال توسعه بوده و همچنین حائز رتبه سوم در بین تمامی حبوبات است (فائو[1]، 2012). نخود یکی از مهمترین محصولات حبوبات در هند و کشورهای مجاور آن است که 90% تولید جهانی را به خود اختصاص داده است (گوپتا و همکاران، 2011). به طور کلی، نخود زراعی در میان کلیه محصولات دانه­ای جهان، رتبه پانزدهم را به خود اختصاص داده است (گائور و همکاران، 2007). این گیاه در دامنه وسیعی از شرایط آب و هوایی، از نواحی نیمه گرمسیری شبه قاره هند و استرالیا تا مناطق مدیترانه­ای حوزه مدیترانه، غرب آسیا، شمال آفریقا، جنوب و جنوب غربی اروپا کشت می­شود (سیدیک و همکاران، 2000). علاوه بر اهمیت این گیاه به عنوان یك منبع مهم برای تغذیه انسان و دام، در مدیریت حاصلخیزی خاك به ویژه در

یک مطلب دیگر :

 

بهبود خوشه بندی شبکه های حسگر بیسیم با بهره گرفتن از ترکیب الگوریتم ژنتیک و کلونی مورچگان - دانلود پایان نامه های ارشد

 مناطق خشك نیز می­تواند بسیار مؤثر باشد (کلارک و همکاران، 2004؛ وارشنی و همکاران، 2009). بذر نخود حاوی 20 تا 30% پروتئین، 40% کربوهیدرات و فقط 3 تا 6% روغن است. همچنین، سرشار از عناصر معدنی نظیر Ca، Mg، K، S، Fe، Mn وZn می­باشد. تولید کارتنوئیدهای سودمندی مانند بتاکاروتن و همین طور قابلیت تثبیت نیتروژن از دلایل دیگر اهمیت این گیاه به شمار می­آید (میلان و همکاران، 2006). نخود از نظر مقدار پروتئین بسیار غنی بوده و از این لحاظ، برای افراد گیاهخوار و آن­هایی که قدرت خرید گوشت را ندارند نقش مهمی در تأمین پروتئین رژیم غذایی ایفا می­نماید. این گیاه به دلیل تثبیت نیتروژن اتمسفر در کاهش مصرف کود نیتروژنه نقش بسزایی بر عهده دارد. توانایی رشد و محصول­دهی نخود در مناطق و شرایط مختلف آب و هوایی حکایت از پتانسیل بالا در این گیاه دارد. با این حال شرایط نامساعد محیطی نظیر خشکی و درجه حرارت بالا در طول دوره رشد به مقدار قابل ملاحظه­ای از عملکرد آن می­کاهد (کوپر، 1998).

تنش خشکی بیشترین تأثیر را در کاهش عملکرد گیاهان دارد. این تنش سبب ایجاد اثرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی متعددی در گیاهان می­گردد. بیشتر فرآیندهای فیزیولوژیکی وابسته به رشد محصولات زراعی متأثراز کمبود آب یا خشکی است که در مطالعات جهانی، خشکی به همراه دمای زیاد و تابش آفتاب از مهمترین عوامل محدود کننده غیر زیستی محصولات زراعی در جهان است (آراس و همکاران، 2002؛ بویر، 1982). به طور کلی خشکی به دو دسته متناوب و انتهای فصل تقسیم می­شود. در طول خشکی انتهای فصل، آب قابل دسترس گیاه کاهش می­یابد و به طور سریع منجر به خشکی می­شود و رشد محصولات زراعی کاهش می­یابد ولی خشکی متناوب در نتیجه باران ناکافی یا آبیاری ناکافی اتفاق می­افتد که لزوما کشنده نیست. بررسی­ها نشان داده است که از بین تنش­های مختلف زیستی و غیر زیستی، تنش خشکی به تنهایی علت کاهش 50 درصد عملکرد نخود است (آنبسا و بجیگا، 2002؛ سکسینا، 2003). همچنین به این علت که نخود زراعی، اغلب در مناطق خشک و نیمه خشک، تحت شرایط دیم کشت می­گردد و از آن جایی که تقریبا 90% محصول جهانی آن، در شرایط دیم تولید می­شود، بنابراین تنش خشکی مهمترین عامل محدود کننده آن به شمار می­رود (میلان و همکاران، 2006).

کشاورزی در اکثر مناطق جهان با استفاده زیاد آب همراه است که با افزایش روز افزون جمعیت و افزایش خشکسالی­های مکرر میزان آب در دسترس برای تولیدات کشاورزی در حال کاهش است. لذا خشکی به عنوان یکی از تنش­های محیطی محدود کننده عملکرد محصولات زراعی مطرح می­باشد که یکی از راه­های مطمئن بر فائق آمدن بر این مشکل اصلاح برای تحمل به تنش خشکی است. در عین حال واریته­های زودرس نخود با قابلیت فرار از خشکی انتهای فصل توسعه یافته­اند، اما بلوغ زودرس روی سقف عملکرد محصول اثر می­گذارد و توانایی محصول زراعی برای بهره برداری از دوره رشد را کاهش می­دهد (جانسون و همکاران، 1997).

نشانگرهای مولکولیDNA[2] به طور وسیع در بررسی تنوع ژنتیکی حاصل از موتاسیون­ها یا اشتباهات در همانندسازی DNA و یا تفاوت­های ذاتی و فردی مورد استفاده قرار می­گیرند و بر خلاف نشانگرهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی، تحت تأثیر محیط قرار نگرفته و از لحاظ تعداد نامحدود و در تمام مراحل رشد گیاه قابل استفاده بوده و تغییری نمی­کنند. علاوه بر کاربرد آن­ها در تهیه نقشه ژنتیکی، در اصلاح نباتات برای تشخیص تنوع ژرم پلاسم و محصولات زراعی بکار می­روند. نشانگرهای مولکولی یکی از بهترین راه­ها برای بررسی تنوع ژنتیکی و زیستی در میان گونه­ها بوده و به دلیل دارا بودن ویژگی­هایی چون تشخیص آسان افراد هتروزیگوت و هموزیگوت، نداشتن اپیستازی، قابلیت وراثت، تشخیص در مراحل مختلف حیات گیاه، عدم محدودیت به مواد بیولوژی، دقت بسیار بالا و آسان بودن اندازه­گیری، در سال­های اخیر در امور اصلاح گیاهان زراعی بسیار رایج شده است (ملشینگر، 1990؛ میلان و همکاران، 2006).

گذشته از بروز دوره­های خشکسالی و کاهش بارندگی­ها طی سالیان اخیر، تغییرات اقلیمی ناشی از اثرات گلخانه­ای، تشدید پدیده خشکی را در پی داشته است که به عنوان چالشی اساسی برای عملکرد و تولید گیاهان زراعی مطرح می­باشد. قسمت اعظم وقوع و شدت تنش خشکی خارج از کنترل است و تنها مسیر مطمئن برای کاهش پیامدهای آن تولید گیاهان متحمل و یا ایجاد صفات دیگری چون فرار از خشکی است. بررسی­های انجام شده توسط متخصصان اصلاح نباتات و زیست شناسان مولکولی حاکی از آن است که پاسخ گیاهان به تنش­های محیطی (غیر زیستی) عموماً بصورت چند ژنی و در قالب اثرات افزایشی و غیر افزایشی ژن­ها کنترل می­شود (پنجابی- سابهاروال و همکاران، 2009). بدلیل طبیعت متغیر تنش­ها و حساسیت فنوتیپ گیاه و نیز مشکلات انتقال صفت تحمل به تنش در ژنوتیپ­های منتخب، روش­های سنتی اصلاح نباتات با موانع جدی روبرو است. لذا ترکیبی از شیوه­های جدید مولکولی نظیر گزینش بوسیله نشانگرهای DNA وQTL[3] می­تواند تسریع این فرآیندها را در پی داشته باشد (رن و همکاران، 2005). بنابراین در تحقیق حاضر از ژنوتیپ­های متحمل و حساس استفاده شد که در گذشته مطالعات اولیه فیزیولوژیکی تنش خشکی در دانشگاه فردوسی مشهد بر روی آن­ها انجام شده است. ضمناً نشانگر مورد استفاده در این تحقیق ISSR[4] بود که به دلیل داشتن آغازگرهایی با طول 16 تا 25 جفت باز از طول بیشتری نسبت به آغازگرهایی مانند RAPD[5] (10 جفت باز) برخوردار بوده و بنابراین امکان تکرار پذیری آن­ها بالاتر بود.

در این تحقیق برای بررسی تفاوت احتمالی بین ژنوتیپ­های متحمل و حساس از 13 آغازگر استفاده شد. هدف از این کار سهولت تشخیص تحمل به تنش خشکی با کمک نشانگرهای مولکولی و همچنین کسب اطمینان بیشتر نسبت به روش تشخیص فیزیولوژیک بود. نشانگرهای مولکولی در این تحقیق به عنوان راهی برای تشخیص تحمل به تنش خشکی فارغ از شرایط محیطی تأثیرگذار بکار برده می­شوند.

فصل دوم

 

 

بررسی منابع

2-1- نخود و اهمیت آن

در حال حاضر حبوبات یکی از مهمترین منابع پروتئینی در رژیم غذایی بسیاری از مردم کشورهای در حال توسعه است. رژیم غذایی در این کشورها عمدتاً نشاسته است که از گیاهانی مثل برنج، گندم، ذرت، ارزن و گیاهان غده­ای مثل سیب زمینی بدست می­آید. آن­چه مسلم است مقدار پروتئین در این محصولات کم بوده و سوء تغذیه میلیون­ها انسان ساکن در این کشورها یکی از مشکلات حاد این مناطق می­باشد. لذا در این مناطق مصرف پروتئین­های گیاهی نظیر حبوبات که سرشار از پروتئین هستند، اهمیت قابل توجهی دارد (باقری و همکاران، 1379). نخود (Cicer arietinum L.)از جمله حبوبات و یکی از قدیمی­ترین گیاهان زراعی است که توسط بشر کشت شده است. نخود عمدتاً در جیره غذایی انسان به خصوص در برنامه غذایی طبقات کم درآمد جامعه نقش اساسی داشته و در مقایسه با غلات از تولید پروتئین قابل توجهی در واحد سطح برخوردار است (باقری و همکاران، 1379). به احتمال زیاد نخود از نواحی جنوب شرقی ترکیه و مناطق مجاور آن در سوریه منشأ گرفته است (سینگ، 1997).

تنش­های مختلفی باعث کاهش عملکرد در نخود می­شود. این تنش­ها به دو گروه زیستی و غیر زیستی قابل تقسیم می­باشند. هرچند نخود گیاهی مقاوم به خشکی است و دمای پایین را نیز تا حدی به خوبی تحمل می­کند ولی دمای مطلوب رشد آن بین 20 تا 30 درجه سانتیگراد است. این گیاه در زمان گلدهی به گرما و تنش خشکی حساس می­باشد که این دو عامل بیشترین تأثیر را در کاهش محصول در کشت­های بهاره و دیم اعمال می­کنند (باقری و همکاران، 1386).