فصل اول: مقدمه  مقدمه………………………………………………………………………………………………………………….19 1-1-          کلیات……………………………………………………………………………………………………..19 1-2-1- گیاهان و تنش‌های محیطی………………………………………………………………………21 1-2-2- تنش خشکی…………………………………………………………………………………………22 1-2-3- لزوم معرفی گیاهان متحمل به خشکی……………………………...…………………….23 1-2-4- کاهش رشد گیاه تحت تنش خشکی………………………………...…………………….24 1-2-5- تنش خشکی و اختلال در فعالیت گیاه…………….….………………………………….25 1-2-6- مکانیم های تحمل خشکی…………………..…….…………………………………………..26 1-2-3 آنزیم‌………………………………………………………………………………………………………28 1-2-3-1 اصول کلی واکنش های آنزیمی…………………………………………....………………29 1-2-3-2 سوپراکساید دیسموتاز……………………………………………………………………….29 1-2-3-3 کاتالاز………………………………………………………………………………………………30 1-2-3-4 آسکوربات پراکسیداز…………………………………………………………………………30 1-2-4 بررسی ژن‌های واکنش دفاعی…………………………………………………………………..31  1-2-5 بیان ژن…………………………………………………………………………………………………..32 1 -2-6-1 تعریف و مفهوم Real- Time PCR………………………………………………..….33 1-2-6-2 استفاده از رنگ‌آمیزی فلورسنت DNA مانند SYBR Green…………….….34 1-2-6-3 مزایای روش Real- Time PCR…………………………………………………..……..34 1-2-6-4 روش های سنجش با Real- Time PCR………………………………………………34 1-2-6-5 روش بررسی کمی بیان ژن یا quantetive real-time PCR………………….37 1-2-6-6 آنالیز کمی mRNAبا استفاده از Real- Time PCR………………………………37 2 بررسی منابع……………………………………………………………………………………………………..43 2-1 تاثیر تنش خشکی بر بیان ژن‌ها……………………………………………………………………..46 3 مواد و روش‌ها……………………………………………………………………………………………………49 3-1 تهیه مواد گیاهی…………………………………………………………………………………………..49 3-2 تعیین سطح تنش خشکی القاشده به گیاه ……………………………………………………..49 3-3 اندازه‌گیری صفات مورفولوژی…………………………………………………..……………………50 3-4 مطالعات بیوشیمیایی…………………………………………………………………...………………..51 3-4-1 سنجش فعالیت آنزیم‌ها…………………………………………………………...……………….51 3-4-1-1 تهیه عصاره گیاهی……………………………………………………………….……………….51 3-4-1-2 استخراج پروتئین………………………………………………………………….…………….52 3-4-1-2-1 روش اندازه‌گیری میزان پروتئین کل…………………………………...……………52 3-2-1-2-2 رسم منحنی استاندارد……………………………………………………….……………52 3-2-1-3 فعالیت آنزیمی آسکوربات پراکسیداز……………………………………..……………53 3-2-1-4 فعالیت آنزیمی کاتالاز…………………………………………………………….……………54 3-2-1-5 فعالیت آنزیمی سوپر اکسید دیسموتاز…………………………..……………………..54 3-2-1-6 فعالیت آنزیمی سوپراکسید از……………………………………….……………………..55 3-2-1-7 سنجش میزان پرولین ……………………………………………….…………………………55 3-2-2 تجزیه‌وتحلیل آماری……………………………………………………...…………………………56 3-3 مطالعات مولکولی………………………………………..……………………………………………….56 3-3-1 استخراج RNA ……………………………………………………………………………………….56 3-3-1-1 استخراج RNA با روش ترایزول………………..…………………………………………..56 3-3-1-2 بررسی کیفیت و کمیت RNA استخراج‌شده…....……………………………………57 3-3-2-1 الکتروفورز…………………………………………………....……………………………………57 3-3-2-2 اسپکتروفتومتری………………………………………....……………………………………57 3-3-3 تیمار نمونه های RNA استخراج‌شده با آنزیم DNase……..………………………..58 3-3-4 سنتز c DNA تک‌رشته‌ای از RNA کل…………………………………………………..58  3-3-5 Real-Time PCR…………………………………………………………………………………59 3-3-5-1 بررسی بیان ژن‌های آنتی‌اکسیدانتی……………………………………………………59 3-3-5-2 بهینه‌سازی شرایط واکنش Real-Time PCR…………………………………..59 3-3-5-3 کنترل آلودگی Real-Time PCR…………………………………………………….60 3-3-5-4 چرخه های حرارتی Real-Time PCR……………………………………………..60 3-3-6 تجزیه‌وتحلیل مشاهدات………………………………………………………………………..60   فصل چهارم: نتایج……………………………………………………………………………………………63 4-1 استخراج RNA کل از بافت برگ و ریشه…………………………………………………….63  4-2 طراحی پرایمر…………………………………………………………………………………………..64 4-2-1 Melting curve……………………………………………………………………………………65 4-3 نتایج بررسی بیان ژن با استفاده از روش Real Time PCR………………………..67 4-3-1 الگوی تظاهر ژن سوپراکسید دیسموتاز…………………………………………………..67 4-3-2 فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز……………………………………………………….69 4-3-3 الگوی تظاهر ژن کاتالاز………………………………………………………………………….70 4-3-4 فعالیت آنزیم کاتالاز………………………………………………………………………………72 4-3-5 الگوی تظاهر ژن پلی فنل اکسیداز…………………………………………………………73 4-3-6 فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز………………………………………………………..74 4-4 نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………….77  4-5 پیشنهادات………………………………………………………………………………………………..78    فصل پنجم: منابع………………………………………………………………………………………………..80        پیوست‌ها

شکل2-1 ……………………………………………………………………………………………………………………54

شکل 3-1…………………………………………………………………………………………………………………..59

شکل 4-1 …………………………………………………………………………………………………………………..60

شکل 4-2……………………………………………………………………………………………………………………60

شکل 4-3………………………………………………………………………………………………………………….63

شکل 4-4…………………………………………………………………………………………………………………..64

شکل 4-5…………………………………………………………………………………………………………………..66

شکل 4-6…………………………………………………………………………………………………………………..66

شکل 4-7………………………………………………………………………………………………………………….67

شکل 4-8………………………………………………………………………………………………………………….68

شکل 4-9………………………………………………………………………………………………………………….69

شکل 4-10………………………………………………………………………………………………………………….70

شکل 4-11………………………………………………………………………………………………………………….71

شکل 4-12 ………………………………………………………………………………………………………………..72

شکل 4-13…………………………………………………………………………………………………………………72

شکل 4-14…………………………………………………………………………………………………………………73

 

 

 

 

فهرست جداول

جدول2-1…………………………………………………………………………………………………………………..46

جدول 3-1…………………………………………………………………………………………………………………57

جدول 3-2…………………………………………………………………………………………………………………57

جدول 3-3………………………………………………………………………………………………………………..58

جدول 3-4…………………………………………………………………………………………………………………59

جدول 4-1…………………………………………………………………………………………………………………..61

 

جدول 4-2 …………………………………………………………………………………………………………………61

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل اول

مقدمه

 

 

 

1-1 مقدمه

کنجد (Sesamum indicum L.) گیاه یک‌ساله، خودگشن با دیرینه زراعی طولانی که به علت دارا بودن درصد زیاد روغن و مقدار مناسب پروتئین به‌عنوان یک منبع تغذیه‌ای محسوب می‌شود (نصر، 1382). سطح زیر کشت جهانی كنجد در سال 2010 میلادی، در میان 10 کشور عمده تولیدکننده کنجد در جهان، کشور میانمار با تولید 000/720 تن در رتبه اول تولید قرار دارد. کشور هند با تولید 000/620 تن در رتبه دوم و چین با تولید 000/590 تن در رده سوم قرار دارد که در این‌ بین ایران با تولید 31848 تن در رده دهم قرار دارد. متوسط عملکرد کنجد در جهان در این سال 490 کیلوگرم در هکتار بوده است (فائو، 2010). مناطق اصلی کشت کنجد در کشور استان‌های فارس، خوزستان، جیرفت، بوشهر، اردبیل (مغان)، خراسان شمالی می‌باشد. پنج استان فارس، خوزستان، جیرفت، خراسان رضوی و اردبیل همه‌ساله 80 درصد سطح زیر کشت کنجد کشور را به خود اختصاص داده‌اند. در سال 1391 سطح زیر کشت کنجد در کشور به 43475 هکتار با تولید 39614 تن و عملکرد 912 کیلوگرم در هکتار بوده است.

یک مطلب دیگر :

کنجد به اسامی Till, Simsim, Gingelly, Benni,Seed معروف است. كنجد از دانه‌های روغنی مناطق گرم و نیمهگرم است، ولی كشت ارقام جدید آن به مناطق معتدله نیز گسترش‌یافته است. این گیاه دارای ارقام محلی زیادی است و در اغلب كشورها توسط كشاورزان خرده‌مالک و به‌صورت سنتی كشت و كار می‌شود (وایز، 2000). مقدار روغن در زمان رسیدگی فیزیولوژیكی به سطح ثابتی می‌رسد و تا زمان رسیدگی بذر نوسان اندكی دارد (فلوئر و داونی، 1970). آبیاری می‌تواند موجب افزایش مقدار روغن شود، درصورتی‌که تنش خشكی (میلر و رایتن، 1987) موجب كاهش آن می‌شود و به‌طورکلی عوامل محیطی اثرات معكوس بر مقدار روغن و پروتئین دارند. ازنظر درصد روغن و عملكرد روغن دانه ارقام مقاوم به تنش موفق‌تر عمل می‌نمایند (اسمیت، 1990). کشور ایران ازنظر اقلیمی در منطقه خشک نیمه‌خشک دنیا قرار دارد، ازاین‌رو خشکی یکی از مشکلات پیش روی زراعت کشور ماست. خشکی سبب تغییرات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی متعددی در گیاهان می‌شود ضمن اینکه تحمل به خشکی در گیاهان نیز خصوصیتی ثابت نبوده و ممکن است در مراحل مختلف رشد هرگونه، متفاوت باشد (سایرام،2001). به‌طورکلی گیاهان، طیف وسیعی از تنش‌های محیطی را که نهایت منجر به بروز تنش اکسیداتیو می‌شود، درک می‌کنند. مکانیسم مقاومت در برخی از تنش‌ها به‌صورت یک ارتباط درونی و نتیجه یک برنامه‌ریزی هماهنگ و پیچیده است. در شرایط تنش عدم توازن بین فرآیند جذب انرژی و مصرف آن توسط اندام فتوسنتزی باعث تولید انواع اکسیژن فعال (ROS) و ناتوانی گیاه در مهار آن می‌گردد که درنهایت منجر به بروز تنش در غشای سلول و بروز علائم ناشی از صدمات اکسیداتیو شود (بلوخینا و همکاران، 2003). افزایش میزان رادیکال‌های فعال اکسیژن در گیاه باعث می‏شود که برای کاهش اثرات سمی تنش اکسیداتیو ناشی از تنش خشکی، مکانیسم‌های متنوعی در گیاه فعال شود. در این شرایط میزان آنتی‌اکسیدانت­ها افزایش‌یافته و آنزیم‌های مهارکننده ROSها در جهت کاهش اثرات سمی ناشی از تنش اکسیداتیو حاصل از تنش خشکی، افزایش پیدا می‌کنند (كافی و همكاران،1382). برای مقابله با تنش اکسیداتیو آنزیم‌های آنتی­‌اکسیدانت نظیر کاتالاز (CAT)، پراکسیداز (POD)، آسکوربات پراکسیداز (APX)، سوپر­اکسید ­دیسموتاز (SOD) و گلوتاتیون ردوکتاز (GR) باعث حذف و غیرفعال شدن گونه های فعال اکسیژن می‏شوند (دیرینک و مونتاگو،2002).

لذا بررسی اثرات تنش خشکی و الگوی رفتاری آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت، می‌تواند به درک مکانیسم‌های دخیل در القاء مقاومت یا تحمل به گیاه کمک نماید، چراکه همبستگی بالایی در تحمل به تنش‌های محیطی و تغییرات غلظت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت در گیاهان فتوسنتز کننده وجود دارد. از سوی دیگر با عنایت به اینکه سنتز هر ماده‌ای در سلول تحت کنترل ژن‌های مسئول سنتز آن است انتقال این ژن­ها به گیاهان دیگر و تولید ارقام محتمل به خشکی دور از ذهن نخواهد بود.

اهداف تحقیق حاضر عبارت‌اند از:

1- مقایسه الگوی بیان برخی ژن‌های دخیل در تنش خشکی در سطح آنزیم شامل کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز و پراکسیداز در بافت برگ و ریشه

• بررسی الگوی بیان برخی ژن‌های دخیل در تنش خشکی در سطح ترانسکریپتوم

 

 

 

 

 

 

1-2 کلیات

1-2-1 گیاهان و تنشهای محیطی

 

گیاهان در دوره حیاتشان با انواع تنشهای محیطی مواجه می‌شوند، این تنش‌ها شانس نمو و بقای گیاهان را محدود می‌کنند. در بسیاری از نقاط کره خاکی شرایط مناسب رشد فقط برای مدت کوتاهی دوام دارد و گیاهان مجبورند که در همین زمان کم، مراحل اساسی رشد خود را انجام دهند در برخی نقاط هم که شرایط برای رشد مناسب است، افزایش تراکم و تعداد گیاهان عامل ایجاد رقابت برای گیاهان در به دست آوردن مواد غذایی، آب و نور است (لارچر و همکاران، 2001).

درمجموع تنش یعنی شرایط نامناسبی که حتماً مرگ آنی در پی نداشته و به‌طور دائم یا موقت در یک محل اتفاق می‌افتد ولی بر عملکردهای حیاتی موجودات تاثیرداشته باشد (والتر و همکاران، 1985). از قوانین حرکت نیوتن چنین استنباط شده است که اگر هر موجودی تحت تاثیرعملی (تنش) قرارگیری عکس‌العملی (واکنش) از خود نشان می‌دهد. واکنش می‌تواند برگشت‌پذیر یا برگشت‌ناپذیر باشد. اگر واکنش از شدت کافی برخوردار باشد موجود زنده دچار یک تغییر پایدار یعنی صدمه یا مرگ می‌شود.

به‌هرحال دانشمندان علوم گیاهی تنش را با دو تعریف بوم‌شناختی و بیوشیمیایی موردتوجه قرار می‌دهند. تنش در مفهوم بوم‌شناختی: فشارهای زیست‌محیطی است که نسبت تولید ماده خشک را در قسمتی از گیاه یا تمامی آن محدود می‌کند اما تنش ازنظر بیوشیمیایی به معنی اختلال در تولید طبیعی ترکیبات مختلف گیاهی است. امروزه تنش را به دو گروه طبقه‌بندی می‌کنند اول تنش‌های زیستی^[1]: تنش‌هایی که حاصل حمله یک موجود زنده به موجود زنده دیگر است مانند آفت‌ها، پاتوژنها و آللوپاتی؛ دوم تنش‌های غیر زیستی^[2] شامل:

1- باد، فشار، صدا، نیروهای مغناطیسی و الکتریکی

2- شیمیایی، مثل شوری، یونی، علف‌کش‌ها و…

3- تشعشع، مثل پرتوهای A-B, UV- UV

4-آب، مثل غرقابی و خشکی

5- دما، مثل گرماو سرما

هر نوع از تنش‌ها در وهله اول تنش اولیه محسوب شده و منجر به تغییراتی در سیستم زیستی می‌شود.

اگر مدت‌زمان تنش اولیه کوتاه باشد اثرات آن در حد چند ثانیه یا دقیقه مشاهده می‌شوند؛ اما اگر مدت‌زمان بروز تنش طولانی باشد تنش ثانویه پدید آمده و آسیب حاصل از آن غیرمستقیم خواهد بود. گیاهان نیزمانندجانوران برای مقابله با این شرایط ناسازگارو سخت با استفاده از مکانیسم‌های متفاوت با تنش مقابله می‌نمایند که این مکانیزم‌ها شامل سازش و مقاومت بوده که مقاومت خود شامل تحمل کردن، اجتناب و فرار می­باشد (پارساد، 1996).