1-3-5- فاکتورهای ویرولانس (بیماری زایی) 19

1-3-5-1- ﻣﻮاد ﺗﺠﻤﻌﯽ.. 20

1-3-5-2- سیتولیزین.. 21

1-3-5-3- ژلاتیناز. 21

1-3-5-4- فرومون ها 22

1-3-5-5- ﻟﯿﭙﻮﺗﯿﮑﻮﺋﯿﮏ اسید. 22

1-3-5-6-  ﻫﻤﻮﻟﯿﺰﯾﻦ اﻧﺘﺮوﮐﻮكوس فکالیس… 23

1-3-5-7-  آﻧﺘﯽ ژن آﻧﺪوﮐﺎردﯾﺘﯽ اﻧﺘﺮوﮐﻮكوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ ((EfaA 23

1-3-5-7-1- ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ.. 24

1-3-5-8- ادهسین ﮐﻼژن  اﻧﺘﺮوﮐﻮكوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ (ACE) 24

1-4- اپیدمیولوژی انتروکوکوس فکالیس….. 27

1-5- اهمیت بالینی… 28

1-5-1- بیماریزایی: 29

1-5-1-1- باکتریمی: 29

1-5-1-2- ﻋﻔﻮﻧﺖ ﻣﺠﺎری ادراری: 32

1-5-1-3- اندوکاردیت.. 33

1-5-1-4- ﻋﻔﻮﻧﺖ ﻫﺎی داﺧﻞ ﺷﮑﻤﯽ، ﻟﮕﻨﯽ و ﺑﺎﻓﺘﻬﺎی ﻧﺮم. 33

1-5-1-5- ﺳﺎﯾﺮﻋﻔﻮﻧﺘﻬﺎی اﻧﺘﺮوکوکی.. 35

1-6- درمان.. 36

1-7- مقاومتهای آنتی بیوتیکی 37

1-7-1- ﻣﻘﺎوﻣﺖ آﻧﻬﺎ ﺑﻪ ﮔﻠﯿﮑﻮﭘﭙﺘﯿﺪﻫﺎ 39

1-7-2- ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ آﻧﺘﯽ ﺑﯿﻮﺗﯿﮑﻬﺎی ﺑﺘﺎﻻﮐﺘﺎم. 40

1-7-3- ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪآنتی بیوتیکهای ﺗﺘﺮاﺳﺎﯾﮑﻠﯿﻦ.. 41

1-7-4- مقاومت در برابر آنتی بیوتیک های ماکرولیدی.. 42

1-7-5-  ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﮐﻠﺮاﻣﻔﻨﯿﮑﻞ. 43

1-7-6- مقاومت به آمینوگلیکوزید ها 44

1-7-6-1- تاریخچه روند گسترش مقاومتهای آمینوگلیکوزیدی.. 45

1-7-6-2- انواع مقاومت به آمینوگلیکوزیدها 46

1-7-6-3- اهمیت مقاومت آمینوگلیکوزیدی.. 48

1-7-7- ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﭼﻨﺪ داروﺋﯽ.. 42

1-7-8- HLAR و افزایش مرگ و میز (Mortality) 42

1-8- PCR.. 44

1-8-1- Multiplex PCR. 44

 

1-8-2- طراحی و اجرای Multiplex PCR. 45

1-8-3- تیتراسیون اجزای واکنش: 46

1-8-4- شرایط ترموسایکلر: 47

1–9– تعریف واژه ها. 47

فصل دوم

( مبانی و تاریخچه) 51

2- مروری بر منابع. 52

فصل سوم

مواد و روش ها 62

3- مواد و روش ها 62

3-1- ﻧﮕﻬﺪاری ﺳﻮﯾﻪ ﻫﺎ: 62

3–2– ﻣﺤﯿﻂ ﻫﺎی ﮐﺸﺖ ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده 62

3-3- لوازم و تجهیزات مورد استفاده. 62

3-4- محلولهای مورد استفاده و نحوه تهیه آنها. 64

3-5- آزمایش‌های بیوشیمیایی… 66

3-5-1- ﺗﺴﺖ ﮐﺎﺗﺎﻻز. 66

3-5-2- ﺗﻤﺎﯾﺰاﻧﺘﺮوکوک­ها از ﺳﺎﯾﺮ اﺳﺘﺮﭘﺘﻮکوک­ها 67

3-5-3- ﮐﺸﺖ ﺑﺮ روی ﺑﺎﯾﻞ اﺳﮑﻮﻟﯿﻦ آﮔﺎر. 67

3-5-4-  ﺗﺴﺖ ﺗﺨﻤﯿﺮ ﻗﻨﺪآراﺑﯿﻨﻮز. 67

3-6- رﺷﺪ در 10 و 45 درﺟﻪ ﺳﺎﻧﺘﯿﮕﺮاد 68

3-7- ﺗﻌﯿﯿﻦ اﻟﮕﻮی ﺣﺴﺎﺳﯿﺖ آﻧﺘﯽ ﺑﯿﻮﺗﯿﮑﯽ انتروکوکوس فکالیس….. 68

3-7-1- استاندارد نیم مک فارلند سولفات باریم: 70

3-7-2- آﻣﺎده ﮐﺮدن ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﯿﻮن ﺑﺎﮐﺘﺮی : 71

3-7-3- روش اﻧﺠﺎم آزﻣﺎﯾﺶ: 71

3-7-4- بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین.. 72

3-7-5- اﺳﺘﺨﺮاج DNA 73

3-7-5-1- استخراج از باکتری کشت داده شده : 73

3-7-6- اندازه‌گیری غلظت DNA ژنومیك تخلیص شده 73

3-7-7- انتخاب و تهیه پرایمر‌های مناسب.. 73

3-7-7-1- محلول کار پرایمر PCR. 73

3-7-8- روش اجرا Multiplex PCR. 73

3-7-8-1- PCR Amplification: 74

3-7-9- آشکارسازی محصولات PCR. 74

3-7-10- روش انجام الکتروفورز: 76

3-8- روش تجزیه و تحلیل داده ها: 77

3-9- ملاحظات اخلاقی: 78

3-10- مشكلات ومحدویت ها: 78

3-11- متغیر ها: 79

یک مطلب دیگر :

فصل چهارم

4- نتایج مطالعه. 81

4-1- نتایج مربوط به تست بیوشیمیایی… 81

4-2- نتایج مربوط تفکیک جنسیت تمام نمونه ها. 82

4-3- نتایج مربوط به تفکیک جنسیت  تمام نمونه ها. 82

4-4- نتایج مربوط به تفکیک گروه های سنی… 83

4-5- نتایج مربوط به حساسیت آنتی بیوتیکی… 83

4-5-1- نتایج بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین.. 83

4-6- نتایج مربوط به واکنش زنجیره ای پلی مراز. 84

4-6-1- استخراج ژنوم. 87

4-6-2- واکنش  PCR. 90

4-6-3- نتایج مربوط به الکتروفورز محصولات PCR : 91

فصل پنجم

بحث و پیشنهادات.. 102

منابع: 111

منابع: 111

فهرست اشکال

شکل ‏1‑1: ساختار فضایی استرپتومایسین.. 36

شکل ‏1‑2: ساختار فضایی کانامایسین.. 37

شکل ‏1‑3: ساختار فضایی آمیکاسین.. 37

شکل ‏1‑4: ساختار فضایی جنتامایسین.. 37

شکل ‏4‑1: الف) شکل سمت چپ کلونی های رشد کرده انتروکوک بر روی بلادآگار را نشان می دهد. ب) شکل سمت راست محیط کشت بایل اسکولین آگار در شبشه های دربسته 5 سی سی می‌باشد،  تیره شدن محیط که نشان دهنده کمپلس آهن و اسکولین می‌باشد، رشد باکتری را تایید می کند. 77

شکل 43‑2: نتایج تست آرابینوز برای تفکیک سویههای مورد بررسی از همدیگر. 78

شکل 4‑3 : نتایج حاصل از تفکیک نمونههای جمع آوری شده بر اساس جنسیت مورد بررسی. 78

شکل ‏4‑4:  نتایج حاصل از تفکیک نمونههای انتروکوکوس فکالیس در افراد مورد بررسی.. 79

شکل ‏4‑5: نتایج حاصل از تفکیک نمونههای انتروکوکوس فاسیوم در افراد مورد بررسی. 79

شکل ‏4‑6 نتایج مربوط به گروه های سنی که در پژوهش حاضر مورد ارزیابی قرار گرفتند. 80

شکل ‏4‑7: نتایج مربوط به گروه های سنی نمونه های انتروکوکس فکالیس…. 81

شکل ‏4‑8: نتایج حاصل از وضعیت گروههای سنی در ارتباط با نمونههای انتروکوکوس فاسیوم. 81

شکل ‏4‑9 : تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن.  از انتروکوکوس فکالیس ATCC29212 نیز به عنوان کنترل منفی استفاده گردید. 82

شکل ‏4‑10: از مجموع تمام نمونه های انتروکوکوس فکالیس بدست آمده، تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن صورت پذیرفت. از انتروکوکوس فکالیس ATCC29212 نیز به عنوان کنترل منفی  استفاده گردید. 82

شکل ‏4‑11: مقاومت آنتی بیوتیکی انواع نمونه ها به جنتامایسین.. 84

شکل 4‑12: مقاومت آنتی بیوتیکی انواع نمونه ها به استرپتومایسین.. 85

فهرست جداول

جدول ‏4‑1: پرایمرهای استفاده شده در این مطالعه برای پیدا کردن سویه‌های مقاوم به آمینوگلیکوزید. 69

جدول ‏4‑1: نتایج مربوط به جنسیت نمونه های مثبت بدست آمده. مشخص شده است. 80

جدول ‏4‑2: نتایج بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین  برای انتروکوکوس فکالیس     83

جدول ‏4‑3: نتایج بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین  برای انتروکوکوس فاسیوم  83

چکیده

زمینه وهدف: انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم با توانمندی بالا در ایجاد بیماری­های عفونی مانند اندوکاردیت، عفونت ادراری و مننژیت هستند. توانمندی بالای آنها برای کسب ژن­های مقاومت به آنتی بیوتیک، درمان آنها را با مشکلات جدید مواجه کرده است. هدف از این مطالعه بررسی مقاومت افزایشی انتروکوکوس فکالیس و فاسیوم به آنتی بیوتیک های آمینوگلیکوزیدی بوده است.

مواد و روش ها: 100 نمونه انتروکوک از آزمایشگاه بالینی نور تهران، پس از جمع آوری با استفاده از تست های بیوشیمیایی معمول، شناسایی شدند. برای سویه‌های جدا شده تست تعیین حساسیت گونه­ها به آنتی بیوتیک­های آمینوگلیکوزیدی با غلظت­های افزایش یافته جنتامایسین 120 میکروگرم و استرپتومایسین 300 میکروگرم و همین طور دیگر آنتی بیوتیک­های آمینوگلیکوزیدی با استفاده از روش دیسک دیفیوژن انجام شد. در نهایت به منظور شناسایی مولکولی مقاومت، حضور 6 ژن عامل ایجاد مقاومت با استفاده از روش Multiplex PCR بررسی شدند.

نتایج:  از 100 ایزوله، 84% انتروکوکوس فکالیس و 16% انتروکوکوس فاسیوم بودند. با روش دیسک دیفیوژن مشخص گردید 56% از نمونه­ها به هر دو آنتی­بیوتیک جنتامایسین و استرپتومایسین با غلظت­های افزایش یافته مقاوم بودند. همچنین بیشترین مقاومت به تتراسایکلین مشاهده شد و ژن مقاومت در ایزوله­های ادرار بیش از بقیه نمونه­ها وجود داشت. در این مطالعه 18 سویه­ به ونکومایسین نیز مقاوم بودند. نتایج PCR نشان داد حضور ژن­های aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia ، ant(4’)-Ia و aph(3’)-IIIa به ترتیب 60% ، 30% و 50% بودند. 9 ایزوله هر سه ژن را داشتند. همچنین ژن­های aph(2’’)-Ib ، aph(2’’)-Ic و aph(2’’)-Id شناسایی نشدند.

بحث: به دلیل وجود مقاومت دارویی در انتروکوک پیشنهاد می­شود از روش­های مولکولی مانند PCR برای تشخیص سریع و نهایی مقاومت در کنار روش­های دیسک گزاری استفاده شود. تشخیص درست، سریع و قطعی، تنها راه جلوگیری از افزایش مقاومت به آنتی بیوتیک­ها و گسترس پدیده HLAR  است.

کلمات کلیدی: انتروکوکوس فکالیس، انتروکوکس فاسیوم، مقاومت آنتی بیوتیکی، آمینوگلیکوزید، MultiplexPCR

فصل اول

 

کلیات