4-3-3-2 کارآمدی نظام حل و فصل اختلاف سازمان تجارت جهانی. 95
5-3 امتیازات ارکان حل و فصل اختلاف سازمان تجارت جهانی. 97
5-3-1 بند اول : رکن حل اختلاف.. 98
5-3-2 بند دوم : هیات رسیدگی به حل اختلاف.. 98
5-3 -3 بند سوم : رکن استیناف.. 100
6-3 گفتار سوم: سایر اشخاص دخیل در حل و فصل اختلافات.. 102
6-3-1 – بند اول: داوران. 102
6-3-2 بررسی علل رجحان داوری برای حل اختلافات تجاری بین المللی. 103
دادرسی قضایی : 104
6-3-3 داوری بهتر است یا دادرسی قضایی ؟ 105
6-3-4 بررسی قواعد داوری و قواعد سازش اطاق بازرگانی بین المللی (ICC) 107

 

6-3-5 اجرای آراء داوری در نظام های حقوق ملی: 111
6-3-6 بند دوم : کارشناسان. 114
7-3 گفتار چهارم: اجرای احکام و توصیه ها 115
7-3-1 بند اول : مهلت اجرای احکام و توصیه ها 116
7-3-2 بند دوّم : پی گیری و نظارت بر اجرای احکام و توصیه ها 116
7-3-3 بند سوم : جبران خسارت و تعلیق امتیازات.. 117
8-3 نتایج حاصل از این پژوهش نشان می دهد که : 119
فصل 4. 121
روش های سیاسی حل و فصل اختلافات بین المللی. 121
الف ) روش های غیر حقوقی. 121
ب ) روش های حقوقی. 121
4-1 روش های غیر حقوقی حل و فصل اختلافات بین المللی. 122
4-1-1 مذاکره : 122
4-1-2 مساعی جملیه : 122
مساعی جمیله دارای چند مشخصه است: 122
4-1-3 میانجیگری: 123
تفاوت میانجیگری با مساعی جملیه 123
4-1-4 کمیسیون سازش (آشتی:) 124
4-2 روش های حقوقی حل و فصل اختلافات بین المللی. 125
4-2-1 داوری بین المللی. 125
4-2-2 دادرسی یا حل و فصل از طریق فرآیند قضایی (دادگستری بین المللی) 125
تفاوت دادرسی قضایی بین المللی با داوری بین المللی: 126
بررسی تفصیلی روش‌های حل اختلاف در حقوق بین الملل. 126
4-2-3 دادرسی قضایی. 127
4-2-4 داوری.. 128
4-2-5 سازش.. 130
4-2-6 میانجی‌گری.. 130
4-2-7 مذاکره 132
4-2-8 روش‌های ترکیبی. 132

یک مطلب دیگر :

4-2-8-1 پیش مطالعه بی‌طرفانه 132
4-2-8-2 دادرسی اختصاری. 133
4-2-8-3 آمبودزمان. 134
4-2-8-4 میانجی‌گری – داوری. 135
4-2-8-5 دادرسی اختصاری هیأت منصفه 135
4-2-9 مکانیزم حل و فصل اختلاف در سازمان تجارت جهانی. 136
4-2-9-1 مرحله اول : مشورت.. 136
4-2-9-2 مرحله دوم : رویه های اختیاری. 137
4-2-9-3 مرحله سوم : تشکیل هیئت رسیدگی. 138
4-2-9-4 مرحله چهارم : استیناف.. 139
4-2-9-5 مرحله پنجم : غرامت و تعلیق امتیاز. 140
4-2-9-6 مرحله ششم : توسل به اقدامات متقابل. 140
الف : اقدام متقابل هم عرض… 141
ب : اقدام متقابل مشابه 141
ج: اقدام متقابل متفاوت.. 141
4-2-10 مذاکره: 141
4-2-11 مساعی جمیله: 143
4-2-12 میانجی گری. 145
4-2-13 سازش: 146
4-2-14تحقیق. 148
4-2-15 کارشناسی: 149
4-3 نتیجه‌گیری فصل. 150
الف:روش‌های غیرحقوقی. 150
ب:روش‌های حقوقی. 150
فهرست منابع. 153
چکیده
در این پایان نامه در ابتدا پس از طرح کلیات تحقیق به تاریخچه حل و فصل اختلافات بین المللی به طور کلی اشاره شده و در ادامه مطالب، به دو موضوع اصلی تحقیق یعنی نظام حل و فصل اختلافات بین المللی در گات سابق و سازمان تجارت جهانی را بیان کرده و به طور مفصل در رابطه با حل و فصل اختلافات بین المللی تجاری بحث شده و سپس در انتها در خصوص روشهای سیاسی حل و فصل اختلافات بین المللی از جمله مذاکره- میانجی گری- سازش- کارشناسی- تحقیق صحبت شده وراه های حقوقی و قضایی در سازمان تجارت جهانی نیز بیان گردیده و سعی شده تا مطالب مرتبط با موضوع کاملا بررسی و بیان شده باشد و در پایان از موضوع مورد بحث نتیجه گیری به عمل آمده و این تحقیق در مقایسه با مطالب پراکنده در رابطه با موضوع نسبتا کامل می باشد.
کلید واژه: حل و فصل اختلاف- گات- سازمان تجارت جهانی- نظام- روشها- حقوقی- سیاسی- هیات رسیدگی- رکن- استیناف

ش تلفات و خسارت و تسکین آلام بشری در زمان مخاصمات مسلحانه بین المللی و غیر بین المللی
ه- سوابق تحقیق:
در زمینه حقوق بشر و مبارزات صورت گرفته در زمینه تروریسم مجوعه مقالات و کتابهابی وجود دارد اما در مورد بررسی حقوق بشردوستانه در مخاصمات مسلحانه غیر بین­اللملی کم تر پرداخته شده و به صورت پراکنده اشاره مطالبی وجود دارد.
و- روش گرداوری اطلاعات:
روش گردآوری مطالب در تحقیق حاضر، به صورت توصیفی تحلیلی و اطلاعات و داده­های مورد نیاز به روش اسنادی و کتابخانه­ به دست آمده است، و در تهیه مطالب از

 منابع داخلی و خارجی اعم از کتاب­ها، مقاله­ها، تقریرات درسی، پایان نامه­ها وحتی منابع اینترنتی و…. استفاده خواهد شد. همچنین ابزارگرداوری اطلاعات از نوع فیش برداری است.

یک مطلب دیگر :

ز- تقسیم بندی مطالب:
در پایان نامه حاضر تقسیم بندی مطالب به این نحو است که در بخش اول به کلیات پرداخته شد سپس تقسیم بندی موضوعات منازعات  بین المللی(منازاع بین المللی­، موضوعات غیر بین المللی)در ادامه سیر تحول دخالت های بشر دوستانه در قالب مداخله بشر دوستانه پیش از  تکوین منشور و پس از تصویب ملل متحد ومشروعیت آن و در بخش دوم به رعایت حقوق بشردوستانه بین المللی در منازعات غیربین المللی کشورها تکالیفی دارند خواهیم پرداخت و درپایان به بیان نتیجه و پیشنهاد­ها و ذکر منابع پرداخته شده است.
بخش اول:
کلیات مفهوم ومبانی
فصل اول: تعاریف و تاریخچه
مبحث اول: حقوق بشر دوستانه از منظر­،تعاریف مفاهیم
ریشۀ حقوق بین الملل بشر دوستانه ضرورتی نشأت گرفته از پدیده‌ای تلخ و شوم بنام مخاصمات مسلحانه بین المللی و غیر بین المللی است، در حال حاضر، وقوع چنین مخاصماتی اجتناب ناپذیر است و حیات بشری و كرامت او را بشدت تهدید می‌نماید، در این راستا توجه بیشتر به قواعد مقررات حقوق بین الملل بشر دوستانه و رعایت دقیق آنها در مخاصمات مسلحانه امری ضروری و حیاتی است چرا كه حقوق بین الملل بشر دوستانه از لحاظ تاریخی شامل حقوق لاهه و حقوق ژنو می‌باشد اما امروزه، این حقوق به صورت مجموعه واحد در نظر گرفته می‌شود یعنی به طور همزمان هم شامل حقوق لاهه است و هم شامل حقوق ژنو، تصویب پروتكل‌های الحاقی 1977 بیانگر این مطلب است.

2-7-2- پروتئین E7.. 25

2-7-3- پروتئین های L1 و L2.. 28

2-8- تیپ بندی پاپیلوماویروس ها 29

2-9- بیماری زایی.. 29

2-9-1- عفونت پوستی.. 30

2-9-2- عفونت حفره دهانی.. 31

2-9-3- عفونت مجاری تنفسی.. 31

2-9-4- سرطان مقعد. 31

2-9-5- سرطان گردن رحم. 32

2-9-6- HPV در کودکان. 34

2-10- اپیدمیولوژی.. 35

2-11- مطالعه سرطان گردن رحم و عفونت پاپیلوماویروس در ایران. 37

2-12- تشخیص…. 38

2-13- پاسخ ایمنی در برابر HPV.. 40

2-13-1- ایمنی اختصاصی.. 41

2-13-1- 1- پاسخ ایمنی هومورال. 41

2-13-1-2- پاسخ ایمنی سلولی.. 42

2-13-2-پاسخ ایمنی ذاتی.. 43

2-14-  درمان. 44

2-15- پیشگیری.. 45

2-16- واکسیناسیون. 46

2-17- واکسیناسیون علیه HPV.. 47

2-17-1- واکسن های نوترکیب با ناقل زنده 50

2-17-2-واکسن های پروتئینی و پپتیدی.. 51

2-17-3-ذرات شبه ویروس( VLPs). 52

 

2-17-4-  DNA واکسن ها 56

-5-17-2 واکسن های خوراکی.. 59

2-18- اهمیت پاسخ های ایمنی هومورال و واکسن های پیشگیری کننده 63

2-19- اهمیت پاسخ های ایمنی سلولی و واکسن های درمان کننده 64

2-20-ایمونوانفورماتیک در علم واکسن.. 65

2-20-1-ﭘﺎﯾﮕﺎه های داده ها (Databases) 68

2-20-1-1- پایگاه های داده اﯾﻤﻮﻧﻮﻣﯿﮏ… 68

2-20-1-2- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B.. 69

2-20-1-3- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلT.. 72

2-20-2-اﺑﺰارها و اﻟﮕﻮرﯾﺘﻢ های ﻣﺘﻨﻮع ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ.. 73

2-20-2-1-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B.. 74

2-20-2-2-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ﺑﺮ ﻣﺒﻨﺎی ﻣﯿﻞ ذاﺗﯽ آﻣﯿﻨﻮاﺳﯿﺪ. 75

2-20-2-3-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلB ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از روش های ﯾﺎدﮔﯿﺮی ﻣﺎﺷﯿﻦ.. 77

2-20-2-4-روش ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﻏﯿﺮ پیوسته ﺳﻠﻮل B.. 78

2-20-2-5-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ های ﺳﻠﻮل T.. 82

2-20-3- ﮐﺎرﺑﺮدهای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ.. 83

2-21-واکسن همگانی (Universal vaccine) 84

2-22- واكسن سازی معكوس Reverse Vaccinology.. 84

2-23-ادجوانت ها 86

2-24-به دست آوردن قطعه DNA یاژن مورد نظر. 89

2-25-کلونینگ ژن. 90

2-25-1- مراحل کلون کردن ژن. 90

2-25-2- میزبان کلونینگ… 90

2-26- آنزیم های محدود کننده 91

2-26-1-آنزیم لیگاز. 91

2-27- حامل های کلونینگ… 91

2-28-غربالگری وجود ژن. 92

2-29-انواع سیستم های بیانی و مزیت اشرشیاکلی.. 92

2-30-وکتورهای بیان کننده 94

2-30-1- وکتورهای بیان کننده سیستمpET.. 94

2-31-وکتورهای پلاسمیدی.. 96

2-32-توالی شاین دلگارنو(SD)(Shine-delgarno) 97

2-33-استراتژی بیان در سیستمpET.. 97

2-34-نقشه و مشخصات وکتورpET28a(+) 98

2-35-تولید پروتئین نوترکیب.. 99

2-36-مراحل تهیه یک پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 99

2-37-بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب در E.coli. 100

2-38-راهکارهای افزایش تولید پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 101

یک مطلب دیگر :

2-39-تخلیص پروتئین نوترکیب.. 102

2-40- فرضیات و هدف از انجام تحقیق.. 103

2-40-1 -فرضیات.. 103

2-40-2 – هدف از انجام تحقیق.. 103

 

فصل سوم: مواد و روش ها…104

3-1-مجموعه توالی های پروتئین.. 105

3-2-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 105

3-3-قابلیت دسترسی اپی توپ به حلال. 106

3-4-محل های N-Glycosylated.. 107

3-5-ترجمۀ معکوس اولین ساختمان. 107

3-6-بهینه سازی کدون، تعیین کدون های نادر (rare codon) 108

3-7-تولید ساختار واکسن.. 109

3-8-تهیه باکتری مستعد شده 109

3-9-ترانسفورم نمودن پلاسمید بیانی.. 111

3-10- SDS-PAGE. 114

3-11-بیان پروتئین نوترکیب HPV   واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس کم. 115

3-12-کشت انبوه سویه بیانی و تهیه جسم سلولی.. 117

3-13-بیان پروتئین نوترکیب HPV  واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس بالا. 117

3-14-الکتروفورز پروتئین در ژل آکریل آمید در حضور SDS. 119

3-15- رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلوR-350.. 122

3-15-1- روش تهیه محلول ها 122

3-15-2- روش رنگ آمیزی.. 123

3-16- وسترن بلاتینگ… 123

3-16-1- انتقال در تانک… 124

3-16-2- مسدودسازی غشا 125

3-16-3- تشخیص با آنتی بادی.. 125

3-17-تخلیص پروتئین با یون های نیکل متصل به ماتریکس NTA نوترکیب HPV   واکسن کاندید چند اپی توپی روی ماتریکس Ni-NTA.. 126

3-18-بهینه سازی تخلیص…. 127

3-19-ارزیابی پروتئین تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 127

3-20-تخلیص انبوه پروتئین نوترکیبHPV  واکسن کاندید چند اپی توپی.. 128

3-21- دیالیز و تغلیظ پروتئین HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده 134

3-22- ارزیابی پروتئین تخلیص شده 136

3-23- روش برادفورد. 136

3-23-1- طرز تهیه محلول های مورد نیاز. 137

3-23-2- طرز تهیه محلول برادفورد. 137

3-23-3- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین ذخیره با غلظت 1000μic/ml. 137

3-23-4- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین با غلظت 10,100mic/ml 137

3-24- بررسی خلوص پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 138

3-25-بررسی پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با وسترن بلات.. 138

3-26-پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی.. 139

3-27- حیوان آزمایشگاهی.. 139

3-28-ادجوانت‌ فروند ناقص…. 139

3-29-گروه‌های تجربی و واکسیناسیون موش‌ها 140

3-30- بررسی پاسخ های همورال. 141

3-30-1- بررسی سطح آنتی بادی توتال در رقت های مختلف سرمی.. 142

 

فصل چهارم: نتایج ….144

4-1-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 145

4-2- قابلیت دسترسی اپی توپ ها 149

4-3-محل های N-Glycosylated.. 151

4-4-انتخاب اپی توپ ها و اتصال پپتیدها برای تولید ساختمان واکسن.. 153

4-5-ارزشیابی توالی پروتئین.. 155

4-6-ترجمۀ معکوس ساختمان اول. 157

4-7-نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش      SDS-PAGE.. 159

4-8- نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش وسترن بلاتینگ… 161

4-9-نتایج بررسی پاسخ های ایمنی همورال. 162

4-9-1- نتایج بررسی سطح آنتی‌بادی توتال اختصاصی واکسن کاندید. 162

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری………164

2-6-1-1- نشانگرهای مرفولوژیک و زنبور عسل-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 14

2-6-2- نشانگرهای مولکولی——- 16

2-7- نشانگرهای مولکولی و حشرات-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————- 17

2-8- کاربرد اصلی نشانگرهای مولکولی در مطالعات اکولوژیکی حشرات———- 18

2-8-1- برهم‌کنش حشرات و گیاهان میزبان-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 19

2-8-2- برهم کنش حشرات و پاتوژن‌ها-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———- 21

2-8-3- مقاوت به حشره‌کش‌ها—– 22

2-8-4- روابط شکار- شکارگر- پارازیتوئید-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 23

2-8-5- سیستماتیک مولکولی—– 24

2-8-6- حشرات تراریخته———- 25

2-9- میکروستلایت‌ها یا توالی‌های ساده تکرار شونده———— 26

2-10- نشانگر ISSR و کاربرد آن در مطالعات گیاهی و جانوری— 30

2-11- منابع تغییرات و چند شکلی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 31

2-11-1- نمونه DNA————— 32

2-11-2- طبیعت آغازگرهای مورد استفاده:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 32

2-11-3- روش کشف————— 33

2-12- کاربردهای تکنیک ISSR—- 34

2-12-1- انگشت‌نگاری ژنتیکی—- 34

2-12-2- تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 34

2-12-3- نقشه‌یابی ژنتیکی——– 34

2-12-4- تعیین فراوانی توالی‌های ساده تکراری (SSR)———- 35

2-12-5- مطالعه جمعیت‌های طبیعی و گونه‌زایی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 35

2-13- چشم انداز کاربرد ISSR در ژنتیک مولکولی————— 36

 

2-14- کاربرد نشانگر ISSR در حشره شناسی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 37

2-15- نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز—– 38

فصل سوم

مواد و روش‌ها——– 40

3-1- جمع آوری نمونه‌ها———— 41

3-2- استخراج DNA زنبور عسل— 43

3-3- تعیین کیفیت DNA استخراج شده-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——– 45

3-3-1- الکتروفورز DNA در ژل آگارز 1 درصد-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 45

3-3-2- بررسی غلظت DNA استخراج شده-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 46

3-3-3- رقیق سازی DNA استخراجی برای دستیابی به غلظت  ng/µl25—— 47

3-4- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز—– 47

3-5- الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 49

3-6- نمره دهی باندهای مشاهده شده روی آگارز نشانگر غالب ISSR———— 50

3-7- ورود داده‌های حاصل از ژل‌ها به نرم افزار اکسل————- 51

3-8- اندازه گیری فواصل و تشابه‌های ژنتیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 54

3-9- روش های گروهبندی داده ها-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 55

3-10- تجزیه خوشه ای————- 56

3-11- نیکویی برازش خوشه بندی یا ضریب کوفنتیک———– 56

3-12- تجزیه به مولفه های اصلی— 57

3-13- آنالیز داده‌های مولکولی—– 58

3-14- بررسی‌های مورفولوژیکی—- 58

3-15- تجزیه به مؤلفه اصلی——– 60

3-16- آنالیز داده‌های مورفولوژیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 61

فصل چهارم

نتایج—————– 62

بررسی تنوع مرفولوژیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه——– 63

4-2- نتایج مربوط به هفت صفت ظاهری اندازه‌گیری شده روی زنبوران عسل پنج استان ایرانبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 63

4-3- همبستگی خصوصیات ظاهری زنبور عسل پنج استان ایران—————- 64

4-4- ماتریس‌های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران—— 65

4-5- تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مولفه‌های اصلی بر اساس داده‌های مرفومتریکبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 66

4-6- بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه—— 67

4-7- تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان‌های مورد مطالعه– 72

4-8- تعداد باندهای تولیدی در هر نژاد زنبور عسل—————- 72

4-9- تعداد باندهای تولید هر آغازگر و کارایی آنها در تکثیر—— 73

4-10- ماتریس‌های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران—- 74

4-11- تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مولفه‌های اصلی بر اساس داده‌های مولكولی– 74

4-12- بررسی شاخص نشانگری و قدرت تمایز آغازگرهای مورد مطالعه روی زنبور عسلبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——- 76

4-13- تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی  چندشکل در زنبورهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 77

یک مطلب دیگر :

4-14- دندوگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفومتریک————— 78

فصل پنجم

بحث و نتیجه‌گیری— 79

چگونگی کاربرد و آنالیز نشانگر ISSR در تنوع ژنتیکی زنبور عسل- 81

بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبورعسل مورد مطالعه————- 87

پیشنهادات:———- 90

منابع—————– 91

فهرست جداول

جدول 2-1: نام‌های متفاوت و همنام تکنیک ISSR-PCR- 31

جدول3-1: مکان‌ و آدرس‌های محل نمونه برداری زنبور عسل- 42

جدول 3-2 مواد واكنش، ‌حجم و غلظت نهایی اجزای واكنش زنجیره پلیمراز 48

جدول3-3: صفات مرفولوژیک اندازه‌گیری شده 59

جدول 4-1: میانگین هفت صفت مرفولوژیک زنبوران کارگر مورد مطالعه- 63

جدول4-2: اندازه هفت صفت مرفولوژیک زنبور عسل پنج استان ایران- 64

جدول 4-3: همبستگی بین صفات ظاهری اندازه‌گیری شده در زنبور عسل- 65

جدول 4-4: ضریب فاصله مرفولوژیکی  و تشابه مرفولوژیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل- 65

جدول 4-5: لیست آغازگرها، توالی آنها و چند شكلی مشاهده شده در نژادهای زنبور عسل- 68

جدول 4-6: تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان‌های مورد مطالعه- 72

جدول 4-7: ضریب تشابه ژنتیکی و فاصله ژنتیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل  بر اساس نشانگر ISSR- 74

جدول 4-8: میزان برخی شاخص‌های آغازگرهای مورد استفاده در مطالعه تنوع ژنتیکی زنبور عسل- 76

فهرست اشکال

شکل 2-1: نقاشی کشف شده از زنبورداری در والنسیای اسپانیا 6

شکل 2-2: طبقه بندی انواع نشانگرهای ژنتیکی- 17

شکل3-1: پنج استان جمع آوری نمونه‌ی زنبور عسل- 41

شکل3-2: نمایی از مکان‌های جمع آوری نمونه‌های زنبور عسل- 42

شکل 3-3: دستگاه حمام آب مورد استفاده در این آزمایشات– 43

شکل 3-4: دستگاه سانتریفیوژ مورد استفاده در این آزمایشات– 44

شکل 3-5: بررسی کیفیت DNA استخراج شده ژنومی روی ژل آگارز 1 درصد- 46

شکل 3-6: دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتر مورد استفاده در تعیین غلظت DNA- 47

شکل 3-7: برنامه واكنش زنجیره‌ای پلیمراز 49

شکل 3-8: دستگاه‌های PCR مورد استفاده در این آزمایشات– 49

شکل 3-9: تانک‌ الکتروفورز ژل آگارز مورد استفاده در این آزمایشات– 50

شکل 3-10: دستگاه BioDoc Analyzer و سیستم تصویربرداری از ژل آگارز 50

شکل 3-11: باندهای موجود و نمره‌دهی لوکوس‌های موجود حاصل از تصویربرداری ژل‌های آگارز نشانگر ISSR- 51

شکل 3-12: ورود داده‌های حاصل از نمره‌دهی ژل‌های آگارز به نرم افزار اکسل جهت آنالیز- 51

شکل 3-13: نمایی از بال جلویی زنبور عسل و صفات اندازه‌گیری شده 60

شکل 3-14: دستگاه استریومیکروسکوپ مجهز به دوربین مورد استفاده در آزمایشات– 60

شکل 4-1: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه‌ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابهCorr   66

شکل 4-2: مقایسه زنبورهای عسل مورد بررسی با استفاده از روش تجزیه به مولفه‌های اصلی- 67

شکل 4-3: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 1  با استفاده از مارکر bp 50- 69

شکل 4-4: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 2 با استفاده از مارکر bp 50- 70

شکل 4-5: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 3 با استفاده از مارکر bp 50- 70

شکل 4-6: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 4 با استفاده از مارکر bp 50- 71

شکل 4-7: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 5 با استفاده از مارکر bp 50- 71

شکل 4-8: تعداد باندهای تولیدی در نژادهای زنبور عسل- 73

شکل 4-9: تعداد باندهای تولیدی آغازگرهای مورد استفاده 73

شکل 4-10: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابه Jaccard 75

شکل 4-11: پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مختصات اصلی به‌روش ماتریس تشابه Jaccard 75

شکل 4-12: تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی  چندشکل 77

شکل 4-13: دندروگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفولوژیکی- 78

فهرست معادلات

معادله 3-1: محتوای اطلاعات چندشکلی نشانگر- 52

معادله 3-2: میزان چندشکلی نشانگر- 52

معادله 3-3: ارزشمندی باندها 53

معادله 3-4: قدرت حل هر آغازگر- 53

معادله 3-5: میانگین قدرت حل هر آغازگر- 53

معادله 3-6: نسبت چندگانه موثر- 53

معادله 3-7: شاخص نشانگری- 54

معادله 3-8: ضریب تشابه جاکارد- 55

انتقال وکتورهای بیانی به هانسونلا پلی مورفا…………………………………………………………………………12

جداسازی سویه های نوترکیب…………………………………………………………………………………………….12

تنظیم متابولیسم متانول……………………………………………………………………………………………………….12

فاکتور محرک رشد کلنی (G-CSF)…………………………………………………………………………………….13

ژن gcsf………………………………………………………………………………………………………………………….13

پروتئین GCSF………………………………………………………………………………………………………………..13

عملکرد پروتئین GCSF…………………………………………………………………………………………………….14

 

فصل دوم مواد و روش ها

میکروارگانیسم های مورد استفاده………………………………………………………………………………………..17

محیط های کشت مورد نیاز………………………………………………………………………………………………..17

پلاسمیدهای مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………..18

آنزیم ها و کیت ها……………………………………………………………………………………………………………18

آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………………………………18

الکتروفورز افقی محصول PCR و یا نمونه DNA بر روی ژل آگارز………………………………………….19

تخلیص محصول هضم آنزیمی با استفاده از کیت تخلیص از ژل آگارز……………………………………..19

واکنش لیگاسیون قطعات تخلیص شده…………………………………………………………………………………20

تهیه سلول های مستعد ‘E. coli TOP10F به روش تیمار با کلرید کلسیم…………………………………..20

انتقال پلاسمید به سلول های مستعد……………………………………………………………………………………..21

 

بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع………………………………………………………………………………21

PCR بر روی کلنی های باکتریایی/مخمری…………………………………………………………………………..22

استخراج پلاسمید در مقیاس کم………………………………………………………………………………………….22

استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد………………………………………………………………………………………..23

الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید(SDS-PAGE)………………………………………………..24

سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..29

PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf……………………………………………………………………………………….30

کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا………………………………………………………………………31

هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf………………………………………………………………………………………….32

هضم آنزیمی وکتوربیانی  pHan…………………………………………………………………………………………33

کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan………………………………………………………………………33

بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf……………………………………………………………………………….34

هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf…………………………………………………………………………………………35

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf……………………………………………..35

PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین……………………………………………………………………35

کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy………………………………………………….37

بررسی کلون های نوترکیب pGEM-zeo……………………………………………………………………………..38

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf………………………………………………39

هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo……………………………………………………………………39

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی تیمار شده با آلکالین فسفاتاز pHan-gcsf………40

یک مطلب دیگر :

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41

انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا…………………………………41

هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41

الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………..42

تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین………………………..43

بیان پروتئینGCSF  در هانسونلا پلی مورفا…………………………………………………………………………..44

کشت سلولهای مخمری……………………………………………………………………………………………………..44

بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE………………………………………………………………44

تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش………………………………………………………………………………………..45

ایمونوبلاتینگ…………………………………………………………………………………………………………………..46

 

فصل سوم نتایج

سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..49

PCR  اختصاصی بر روی ژن gcsf………………………………………………………………………………………49

طراحی پرایمر های اختصاصی ژن gcsf……………………………………………………………………………….49

بهینه سازی واکنش PCR برای ژن gcsf……………………………………………………………………………….50

کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا………………………………………………………………………51

هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan……………………………………………….51

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf…………………………………………………………………………………52

بررسی کلونها به روش سریع……………………………………………………………………………………………..52

انجام PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf……………………………………………………52

هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf…………………………………………………………………………..53

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf……………………………………………..54

PCR  اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble)…………………………………………………….54

کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy………………………………………………….55

تأیید کلون های نوترکیب pGEM-zeocin……………………………………………………………………………55

بررسی سریع کلونهای نوترکیب…………………………………………………………………………………………..55

هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM-zeo با BglII……………………………………………………………56

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf………………………………………………57

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin……………………………………………………………………57

بررسی سریع کلونهای نوترکیب…………………………………………………………………………………………..57

بررسی کلونها به روش Colony-PCR…………………………………………………………………………………58

برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo………………………………………………………………………58

انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا…………………………………59

هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا………………………………….59

تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسین……………………………………….59

بیان پروتئینGCSF  در هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………….60

تأیید پروتئین نوترکیب تولید شده با روش Immuno-Blotting……………………………………………….61

فصل چهارم :بحث و پیشنهادات

رویکرد کلی پژوهش…………………………………………………………………………………………………………63

فصل پنجم : منابع و پیوست