2-7-2- پروتئین E7.. 25

2-7-3- پروتئین های L1 و L2.. 28

2-8- تیپ بندی پاپیلوماویروس ها 29

2-9- بیماری زایی.. 29

2-9-1- عفونت پوستی.. 30

2-9-2- عفونت حفره دهانی.. 31

2-9-3- عفونت مجاری تنفسی.. 31

2-9-4- سرطان مقعد. 31

2-9-5- سرطان گردن رحم. 32

2-9-6- HPV در کودکان. 34

2-10- اپیدمیولوژی.. 35

2-11- مطالعه سرطان گردن رحم و عفونت پاپیلوماویروس در ایران. 37

2-12- تشخیص…. 38

2-13- پاسخ ایمنی در برابر HPV.. 40

2-13-1- ایمنی اختصاصی.. 41

2-13-1- 1- پاسخ ایمنی هومورال. 41

2-13-1-2- پاسخ ایمنی سلولی.. 42

2-13-2-پاسخ ایمنی ذاتی.. 43

2-14-  درمان. 44

2-15- پیشگیری.. 45

2-16- واکسیناسیون. 46

2-17- واکسیناسیون علیه HPV.. 47

2-17-1- واکسن های نوترکیب با ناقل زنده 50

2-17-2-واکسن های پروتئینی و پپتیدی.. 51

2-17-3-ذرات شبه ویروس( VLPs). 52

 

2-17-4-  DNA واکسن ها 56

-5-17-2 واکسن های خوراکی.. 59

2-18- اهمیت پاسخ های ایمنی هومورال و واکسن های پیشگیری کننده 63

2-19- اهمیت پاسخ های ایمنی سلولی و واکسن های درمان کننده 64

2-20-ایمونوانفورماتیک در علم واکسن.. 65

2-20-1-ﭘﺎﯾﮕﺎه های داده ها (Databases) 68

2-20-1-1- پایگاه های داده اﯾﻤﻮﻧﻮﻣﯿﮏ… 68

2-20-1-2- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B.. 69

2-20-1-3- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلT.. 72

2-20-2-اﺑﺰارها و اﻟﮕﻮرﯾﺘﻢ های ﻣﺘﻨﻮع ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ.. 73

2-20-2-1-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B.. 74

2-20-2-2-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ﺑﺮ ﻣﺒﻨﺎی ﻣﯿﻞ ذاﺗﯽ آﻣﯿﻨﻮاﺳﯿﺪ. 75

2-20-2-3-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلB ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از روش های ﯾﺎدﮔﯿﺮی ﻣﺎﺷﯿﻦ.. 77

2-20-2-4-روش ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﻏﯿﺮ پیوسته ﺳﻠﻮل B.. 78

2-20-2-5-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ های ﺳﻠﻮل T.. 82

2-20-3- ﮐﺎرﺑﺮدهای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ.. 83

2-21-واکسن همگانی (Universal vaccine) 84

2-22- واكسن سازی معكوس Reverse Vaccinology.. 84

2-23-ادجوانت ها 86

2-24-به دست آوردن قطعه DNA یاژن مورد نظر. 89

2-25-کلونینگ ژن. 90

2-25-1- مراحل کلون کردن ژن. 90

2-25-2- میزبان کلونینگ… 90

2-26- آنزیم های محدود کننده 91

2-26-1-آنزیم لیگاز. 91

2-27- حامل های کلونینگ… 91

2-28-غربالگری وجود ژن. 92

2-29-انواع سیستم های بیانی و مزیت اشرشیاکلی.. 92

2-30-وکتورهای بیان کننده 94

2-30-1- وکتورهای بیان کننده سیستمpET.. 94

2-31-وکتورهای پلاسمیدی.. 96

2-32-توالی شاین دلگارنو(SD)(Shine-delgarno) 97

2-33-استراتژی بیان در سیستمpET.. 97

2-34-نقشه و مشخصات وکتورpET28a(+) 98

2-35-تولید پروتئین نوترکیب.. 99

2-36-مراحل تهیه یک پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 99

2-37-بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب در E.coli. 100

2-38-راهکارهای افزایش تولید پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 101

یک مطلب دیگر :

2-39-تخلیص پروتئین نوترکیب.. 102

2-40- فرضیات و هدف از انجام تحقیق.. 103

2-40-1 -فرضیات.. 103

2-40-2 – هدف از انجام تحقیق.. 103

 

فصل سوم: مواد و روش ها…104

3-1-مجموعه توالی های پروتئین.. 105

3-2-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 105

3-3-قابلیت دسترسی اپی توپ به حلال. 106

3-4-محل های N-Glycosylated.. 107

3-5-ترجمۀ معکوس اولین ساختمان. 107

3-6-بهینه سازی کدون، تعیین کدون های نادر (rare codon) 108

3-7-تولید ساختار واکسن.. 109

3-8-تهیه باکتری مستعد شده 109

3-9-ترانسفورم نمودن پلاسمید بیانی.. 111

3-10- SDS-PAGE. 114

3-11-بیان پروتئین نوترکیب HPV   واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس کم. 115

3-12-کشت انبوه سویه بیانی و تهیه جسم سلولی.. 117

3-13-بیان پروتئین نوترکیب HPV  واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس بالا. 117

3-14-الکتروفورز پروتئین در ژل آکریل آمید در حضور SDS. 119

3-15- رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلوR-350.. 122

3-15-1- روش تهیه محلول ها 122

3-15-2- روش رنگ آمیزی.. 123

3-16- وسترن بلاتینگ… 123

3-16-1- انتقال در تانک… 124

3-16-2- مسدودسازی غشا 125

3-16-3- تشخیص با آنتی بادی.. 125

3-17-تخلیص پروتئین با یون های نیکل متصل به ماتریکس NTA نوترکیب HPV   واکسن کاندید چند اپی توپی روی ماتریکس Ni-NTA.. 126

3-18-بهینه سازی تخلیص…. 127

3-19-ارزیابی پروتئین تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 127

3-20-تخلیص انبوه پروتئین نوترکیبHPV  واکسن کاندید چند اپی توپی.. 128

3-21- دیالیز و تغلیظ پروتئین HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده 134

3-22- ارزیابی پروتئین تخلیص شده 136

3-23- روش برادفورد. 136

3-23-1- طرز تهیه محلول های مورد نیاز. 137

3-23-2- طرز تهیه محلول برادفورد. 137

3-23-3- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین ذخیره با غلظت 1000μic/ml. 137

3-23-4- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین با غلظت 10,100mic/ml 137

3-24- بررسی خلوص پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 138

3-25-بررسی پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با وسترن بلات.. 138

3-26-پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی.. 139

3-27- حیوان آزمایشگاهی.. 139

3-28-ادجوانت‌ فروند ناقص…. 139

3-29-گروه‌های تجربی و واکسیناسیون موش‌ها 140

3-30- بررسی پاسخ های همورال. 141

3-30-1- بررسی سطح آنتی بادی توتال در رقت های مختلف سرمی.. 142

 

فصل چهارم: نتایج ….144

4-1-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 145

4-2- قابلیت دسترسی اپی توپ ها 149

4-3-محل های N-Glycosylated.. 151

4-4-انتخاب اپی توپ ها و اتصال پپتیدها برای تولید ساختمان واکسن.. 153

4-5-ارزشیابی توالی پروتئین.. 155

4-6-ترجمۀ معکوس ساختمان اول. 157

4-7-نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش      SDS-PAGE.. 159

4-8- نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش وسترن بلاتینگ… 161

4-9-نتایج بررسی پاسخ های ایمنی همورال. 162

4-9-1- نتایج بررسی سطح آنتی‌بادی توتال اختصاصی واکسن کاندید. 162

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری………164