طبقه بندی پپتیدهای تولیدشده براساس انرژی.. 35

انتخاب بهترین پپتیدها براساس انرژی.. 36

ایجاد ساختار سه بعدی پایدارترین پپتیدها 36

اتصال پپتیدهای طراحی شده باگیرندهTrk B.. 36

بررسی اندرکنشهای پپپتیدی و رسپتور. 38

بخش ازمایشگاهی.. 38

محلولها 38

کشت سلولی.. 38

پاساژسلولی (sub-culture) 39

سلولهای چسبنده. 39

سلولهای سوسپانت.. 40

فریز کردن. 40

طرزتهیهFBS دکمپلمان برای استفاده درکشت سلولی.. 41

ذوب کردن. 41

شمارش سلولی.. 41

MTT Assay. 42

غلظتهای استفاده شده برای پپتید. 43

فلوسایتومتری.. 43

استخراج پروتئین.. 44

مواد مورد استفاده برای جمع آوری کردن(Harvest) سلول. 45

اندازهگیری پروتئین با روش برادفورد. 47

مراحل وسترن بلاتینگ… 47

آماده سازی ژلSDS-PAGE 48

آماده کردن پروتئینها برای Loading در SDS-PAGE.. 50

یک مطلب دیگر :

مرحله ترانسفر. 51

Preparation of solutions. 52

آماده کردن کاغذ pvdf. 53

مرحله بلات کردن. 53

طراحی کتابخانه پپتیدی.. 55

IC50% سلولها 57

پیشگویی ساختار سه بعدی.. 58

تداخل لیگاند – رسپتور. 59

آمینواسیدهای شرکت کننده دراندرکنش… 61

نمایش اندرکنشهای گیرنده  Trk Bبا پپتیدهای طراحی شده. 62

بررسی اثر توکسیک پپتیدهای سنتزشده با آزمون بقا سلول. 65

نتایج فلوسایتومتری.. 71

نتایج وسترن بلات.. 77

اندرکنشهای پپتیدها و رسپتور. 79

بحث.. 82

منابع. 90

خلاصه فارسی

سرطان به عنوان دومین عامل مرگ ومیر بعد از بیماریهای قلبی ساخته شده است،یکی از مهمترین پروتئینهای انکوژن TREKB می باشد که لیگاند اختصاصی آن BDNF(Brain derived neutrophic factor)   می باشد وبیان بیش از حد این گیرنده در سرطانهای پروستات و مولتیپل مایلوما و تخمدان و تیروئید مشاهده شده است.

BDNF  با اتصال خود به گیرنده  TRK B باعث دایمراسیون در این گیرنده و ایجاد سیگنالهایی در مسیرآنژیوژنسیس و افزایش میزان تعداد سلولها می شود ،هدف این مطالعه طراحی پپتیدهایی بر علیه  گیرنده TRK B  (Tropomyosin Receptor B Kinase) به عنوان مهار کننده می باشد،در این مطالعه ابتدا  در قسمت  Insilico کتابخانه پپتیدی با روش sequence tolerance و backrub ساخته شد و بهینه سازی انرژی پپتید با  با استفاده از روش مونتو کارلوانجام شد و  پپتیدهایی با حداکثر پایداری بر اساس انرژی توسط نرم افزارRانتخاب شدند و سپس ساختار سه بعدی پپتیدها با استفاده از روش دینامیک مولکولی با استفاده از نرم افزار7 Hyperchem تعیین گردیدو Docking  این پپتید ها توسط نرم افزار HADDOCK تکمیل گردید،نحوه اتصال آنها توسط نرم افزار  Lighplot  انالیز شد و ساختار سه بعدی این پپتید ها با گیرنده توسط نرم افزار PYMOL نمایش داده شد و در نهایت توالی 2 عدد از بهترین پپتیدها با کمترین انرژی توسط شرکت Tag copeghene دانمارک سنتز شدند .

در قسمت آزمایشگاهی، ابتدا با انجام تست MTT اثر توکسیک پپتید یک و دو در غلظتهای 50 ،200 ،350، 500 نانو مولار و سیکلو تراکسین در غلظت 200 نانو مولار به عنوان کنترل مثبت بر روی رده سلولی ,RPMI822, Sk-ov-3,Ov-car-3U266 مطالعه شد و سپس فلوسایتومتری برای سلولها با کیت ّّّFITC-Annexin V  در غلظتهای 450 و 350 نانو مولار برای پپتید یک و دو و در غلظت 200 نانو مولار برای سیکلو تراکسین انجام گردید، سپس پروتینها بعد از تیمار با استفاده از  لیز بافر ، لیز شده و پروتئین های آنها استخراج گردید و غلظت پروتئین توسط دستگاه اسپکترومتری برادفورد مشخص شد و سپس Western blotting  برای بررسی میزان بیان پروتئینها بعداز تیمار انجام شد.

یافته هانشان داد که پپتیدهای طراحی شده دارای  تمایل اتصال بالایی به رسپتور TrkBمی باشند و باعث مهار رشد سلولی در رده سلولی مذکور شده اند و نتایج این مطالعه نشان داد که مهار رسپتور Trk B می تواند به توقف رشد سلول سرطانی منجر شود.