محمد ایرانی پور

 

میخک یکی از محبوب ترین، اقتصادی ترین و مهم ترین گل های بریدنی به سبب پیوسته گلدهی و رقم های چند رنگ و منحصر به فرد می باشد. محدودیت های موجود در روش های بهنژادی سنتی (تلاقی و گزینش) و داشتن ویژگی های هتروزیگوسیتی بالا در این گیاه سبب شده است که کاربرد فنون جدید یاخته ای – مولکولی برای بهبود ویژگی های اقتصادی این گیاه ضرورت پیدا کند. این پژوهش به منظور بررسی ریزافزایی ارقام استاندارد ’ ‘Rendz-Vousو مینیاتور’Panamera‘ توسط اندام زایی مستقیم و رویان زایی بدنی، تعیین غلظت بهینه ماده گزینشگر کانامیسین و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها انجام شد. بدین منظور آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح به طور کامل تصادفی با 3 تکرار اجرا شد. در این پژوهش، از قطعه های برگ گیاهان رشد یافته در گلخانه با سن 6 تا 8 هفته و پینه برای تهیه ریزنمونه استفاده گردید. انتقال ژن gus به میخک توسط سویه LBA 4404 باکتری Agrobacterium tumefaciens دارای پلاسمید pBI121 بیان كننده ژن بتاگلوكورونیداز انجام شد. نتایج اندام زایی مستقیم نشان داد که میانگین تعداد شاخساره های نابجا برای هر دو رقم با افزایش غلظت BA به 9/0 میلی گرم در لیتر افزایش می یابد در صورتی که با NAA بیشترین تعداد شاخساره های نابجا در غلظت 3/0 میلی گرم در لیتر به دست آمده و با افزایش غلظت آن کاهش می یابد. ارزیابی تأثیر شرایط تاریکی و روشنایی بر باززایی ارقام توسط رویان زایی بدنی در مدت زمان های 30 و 60 روز نشان داد که در شرایط تاریکی مقدار پینه به دست آمده برای هر دو رقم به طور معنی داری بیش از شرایط روشنایی می باشد. نتایج تشکیل پینه و شاخساره نشان داد که رقم ’Panamera‘ بیش از رقم ’Rendz-Vous‘ به کانامیسین مقاوم است. به نظر می رسد آلودگی باکتریایی تشکیل پینه و شاخساره را به عقب می اندازد. بدون آلودگی باکتریایی تشکیل شاخساره در غلظت 50 میلی گرم در لیتر کانامیسین برای رقم ’Rendz-Vous‘ به طور کامل متوقف شد در حالی که برای رقم ’Panamera‘ این اتفاق در غلظت 100 میلی گرم در لیتر کانامیسین صورت گرفت. در بهینه سازی انتقال ژن با اگروباکتریوم تأثیر غلظت باکتری، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری و مدت زمان هم کشتی بر کارایی انتقال ژن مورد ارزیابی قرار گرفت. آزمون شیمیایی- بافتی و تجزیه PCR پیوستن ژن بتاگلوکورونیداز در شاخساره های تراریخت باززایی شده را اثبات نمود. چگالی نوری 5/0، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری به مدت 20 دقیقه و هم کشتی به مدت 3 روز سبب افزایش درصد شاخساره های تراریخت گردید. در این پژوهش رقم استاندارد ’Rendz-Vous‘ نسبت به رقم مینیاتور ’Panamera‘ کارایی انتقال ژن بالاتری نشان داد. اختلاف بین دو رقم در میزان باززایی و کارایی تراریزش به دلیل اندازه کوچکتر ریزنمونه های برگ در رقم مینیاتور ’Panamera‘ قابل توجیه است. گیاهک های باززایی شده از اندام زایی مستقیم، رویان زایی بدنی و تراریزش با اگروباکتریوم در آمیخته پرلایت و ورمیکولیت در شرایط رطوبت نسبی %95 نگهداری و سپس به گلخانه منتقل شدند. این اولین گزارش انتقال ژن به میخک در ایران می باشد.

 

 

 

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                               صفحه

فصل اول: مقدمه. 2

1-1- منشاء. 3

1-2- اصطلاح‌شناسی. 4

1-3- انواع میخك. 4

١-4- گیاه‌شناسی و ریخت‌شناسی میخك. 5

١-5- روش‌های افزایش میخك. 7

1-6- اهمیت و اهداف پژوهش. 7

فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین. 10

2-1- ریزافزایی و کشت بافت میخک. 10

2-1-1- گزینش ریزنمونه و گندزدایی سطحی آن. 10

2-1-2- ریخت زایی و باززایی. 12

2-1-3- رویان زایی بدنی. 13

2-1-3-1- تنظیم کننده های رشد. 14

2-1-3-2- محیط پینه زایی. 16

2-1-3-3- محیط ریشه زایی. 17

2-1-3-4- سن مواد گیاهی و شرایط كاشت. 18

2-1-4- مسیرهای رویان زایی بدنی. 19

2-2- انتقال ژن توسط اگروباكتریوم. 19

2-2-1- اساس ایجاد گال و پلاسمید Ti 20

2-2-2- انتقال T– DNA.. 20

2-2-3- عوامل مؤثر بر انتقال توسط اگروباكتریوم. 22

2-2-3-1- نژادگان (ژنوتیپ). 22

2-2-3-1-1- ریزنمونه های شروع كننده. 22

2-2-3-1-2- سویه باكتری. 24

2-2-3-1-3- چگالی نوری. 25

2-2-3-1-4- انگیزاننده های ژن های بیماری زا. 26

2-2-3-1-5- مدت زمان هم كشتی. 27

2-2-3-1-6- گزینش با کانامیسین. 28

فصل سوم: مواد و روش‌ها. 30

3-1- كشت بافت. 30

3-١-1- مواد گیاهی. 30

3-١-2- قسمت‌های گیاهی مورد استفاده در كشت بافت. 30

3-١-٣- گندزدایی ریزنمونه‌ها و وسایل. 31

3-١-4- آماده‌سازی ریزنمونه‌ها برای استقرار. 32

3-١-5- محیط كشت. 32

3-2- انتقال توسط اگروباکتریوم. 34

3-2-1- مواد. 34

3-2-1-1- بافر STET. 34

3-2-1-2- بافر الكتروفورز. 34

3-2-1-3- بافر CTAB.. 35

3-2-1-4- بافر TE. 35

3-2-1- 5- بافر سنجش GUS. 35

3-2-1-6- بافر بارگذاری. 35

3-2-1-7- محلول ذخیره آنتی بیوتیك كانامیسین. 36

3-2-1-8- محلول ذخیره آنتی بیوتیك ریفامپیسین. 36

3-2-1-9- محلول ذخیره آنتی بیوتیک سفاتاکسیم. 36

3-2-1-10- محلول ذخیره استوسیرینگون. 36

3-2-1-11- محلول ذخیره نفتالن استیک اسید. 37

3-2-1-12- محلول ذخیره بنزیل آدنین. 37

3-2-1-13- محیط كشت LB (Luria–Bertani) 37

3-2-1-14- سویه A. tumefaciens. 37

3-3- روش ها. 38

3-3-1- تهیه ریزنمونه. 38

3-3-2- تهیه محیط های كشت بافت گیاهی. 38

3-3-3- آغازگرها. 40

3-4- روش ها. 40

3-4-1- آماده سازی باكتری برای انجام انتقال ژن به ریزنمونه ها  40

3-4-2- استخراج DNA پلاسمیدهای نو ترکیب. 41

3-4-3- آماده سازی ریزنمونه ها و اگروباكتریوم برای انتقال ژن به میخک. 42

3-4-4- پیش آماده سازی ریزنمونه ها. 43

3-4-5- روش کار انتقال ژن به گیاه. 43

3-4-6- گزینش و باززایی گیاهان تراریخت. 44

3-4-7- استخراج DNA از بافت های گیاهی با استفاده از محلول CTAB   45

3-4-9- روش کار. 47

3-4-10- آزمون زنجیره ای پلیمراز ((PCR.. 49

3-4-11- تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR.. 51

3-4-12- آزمون شیمیایی- بافتی برای تعیین فعالیت تراریخت GUS در شاخسارههای تراریخت. 51

3-4-13- واکاوی داده ها. 52

فصل چهارم: نتایج و بحث. 54

4-1- کشت بافت. 54

4-1-1- تشکیل شاخساره نابجا از ریزنمونه های برگ ارقام استاندارد و مینیاتور میخک. 54

4-1-1-1- مواد گیاهی. 54

4-1-1-2- گندزدایی. 54

4-1-1-3- ریزنمونه ها و محیط باززایی. 55

4-2- انتقال ژن با واسطه اگروباکتریوم. 56

4-2-1- آزمایش مقدماتی. 58

4-2-1-1- گزینش با کانامیسین. 58

4-2-2- تولید گیاهان تراریخت. 61

4-2-3- تأیید گیاهان تراریخت با سنجش فعالیت GUS. 63

4-3- آنالیز PCR.. 64

4-4- تأثیر غلظت باکتری. 67

4-5- تاثیر زمان مایه زنی. 71

4-6- تاثیر مدت زمان هم کشتی بر کارایی انتقال ژن. 69

4-7- برهمكنش سه عامل چگالی نوری باکتری، مدت زمان مایه زنی ریزنمونه ها با باکتری و مدت زمان هم کشتی. 73

پیشنهادها. 77

منابع. 78

 

 

 

 

فهرست جدول­ها

 

 

عنوان                                                                                                             صفحه

جدول 1-3- مواد تشکیل دهنده محلول­های پایه محیط كشت MS.  34

 

جدول 2-3- انواع محیط های کشت مورد استفاده.. 40

جدول 3-3- مواد مورد نیاز برای استخراج DNA ژنومی 47

جدول 4-3- مواد لازم در واكنش PCR.. 51

جدول 5-3- دوره های دمایی واکنش های PCR.. 51

جدول 1-4- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریزنمونه های برگ رقم استاندارد’Rendz-Vous‘ .  57

جدول 2-4- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریز نمونه های برگ رقم ’Panamera‘.. 57

جدول 3-4- اندام زایی از ریزنمونه های برگ دو رقم میخک روی محیط دارای کانامیسین با و بدون آلودگی توسط Agrobacterium tumefaciens LBA 4404.  60

جدول4-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در تیمار چگالی های نوری مختلف باکتری.. 70

جدول 5-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در مدت زمان های مایه زنی ریز نمونه ها با باکتری.. 71

جدول6-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در مدت زمان های هم کشتی مختلف ریز نمونه ها با باکتری  74

جدول 7-4- مقایسه درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در سه عامل چگالی نوری باکتری، زمان مایه زنی با باکتری و مدت هم کشتی ریز نمونه ها با باکتری در سه سطح مختلف برای رقم ’Rendz-Vous‘  76

جدول 8-4- مقایسه درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در سه عامل چگالی نوری باکتری، زمان مایه زنی با باکتری و مدت هم کشتی ریز نمونه ها با باکتری در سه سطح مختلف برای رقم ’Panamera‛ 77

 

 

 

 

فهرست نگاره­ها

 

 

عنوان                                                                                                                 صفحه

نگاره1-3. جایگاه های برشی پلاسمید pBI121. 43

نگاره1-4- ایجاد شاخساره و پینه پس از گذشت 8 تا 10 هفته از مایه کوبی برای رقم
Rendz–Vous 63

نگاره 2-4- سنجش ژن GUS در رقم ‘Rendz–Vous‘. 64

نگاره 3-4- سنجش ژن GUS در رقم ‘Panamera‘ 65

نگاره 4-4- نتایج آزمون PCR در رقم ’Rendz–Vous‘. وجود گیاهان تراریخت میخک با جفت آغازگرهای ژن GUS برای تأیید وجود این ژن. چاهک M نشانگر kb10، چاهک 1

یک مطلب دیگر :

 

یامدهای شبکه اجتماعی:/پایان نامه درمورد رسانه اجتماعی

 کنترل منفی، چاهک 2 تا 7 نمونه های مربوط به گیاهان تراریخت و چاهک 8 و 9 مربوط به گیاهان ناتراریخت…. 66

نگاره 5-4- نتایج آزمون PCR در رقم ‘Panamera‘. گیاهان تراریخت میخک با جفت آغازگرهای ژن gus برای تأیید وجود این ژن. چاهک M نشانگر kb10، چاهک 1 کنترل منفی، چاهک 2 تا 4 نمونه های مربوط به گیاهان تراریخت و چاهک 5 تا 7 مربوط به گیاهان ناتراریخت. 67

نگاره 6-4- سنجش ژن GUS در ریزنمونه های پینه (A,B,C) و اندام های گل (D) باززایی شده در رقم ‘Rendz–Vous‘. 68

 

کوتاهه­ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6- بنزیل آمینو پیورین (6-benzyl amino-9-(tetrahyd­ropyran-2– yl)-9H-purine)	BAP
پیشبر ویروس موزائیک گل کلم (Cauliflower mosaic virus promotor)	CaMV 35S
آب دوبار تقطیر (Double distilled water)	DDW
توفوردی (2و4- دی­کلروفنوکسی استیک اسید) (2,4-dichlorophenoxy acetic acid)	2,4-D
اتیلن دی­آمین تترا استیک اسید (Ethylene diamine tetra acetic acid)	EDTA
بتاگلوکورونیداز (β-Glucuronidase)	GUS
محیط کشت لوریا – برتانی (Luria-Bertani Medium)	LB
محیط کشت موراشیگی و اسکوگ (Murashige and Skoog Medium – 1962)	MS
نفتالن استیک اسید (Naphthalene acetic acid)	NAA
ژن نئومایسین فسفوترانسفراز (Neomycin phosphotransferase gene)	nptІІ
پلی­وینیل­پیرولیدون (Polyvinylpyrolidone)	PVP
بافر سوکروز تریس اتیلن دی آمین تترا استیک اسید تریتون (Sucrose tris EDTA tritone buffer)	STET
بافر تریس بورات اتیلن دی­آمین تترا استیک اسید (Tris burate EDTA buffer)	TBE
بافر تریس اتیلن دی­آمین تترا استیک اسید (Tris EDTA buffer)	TE
DNA منتقل شونده (Transferred DNA)	T-DNA
تیدیازرون (Thidiazuron)	TDZ
وزن / حجم (Weigh / Volume)	W/V