2-3-4 زیرواحد CagA هلیکوباکتر پیلوری………………….. 14

2-3-5 نقش CagA در سرطان……………………………. 15

2-3-6 پاتوفیزیولوژی…………………………….. 15

2-3-7 التهاب، ورم معده و زخم……………………………. 16

2-3-8 جزیره بیماریزائی Cag……………………………..

2-3-9 سرطان……………………………. 18

2-3-10 آسیب شناسی…………………………….. 19

2-3-11 پیشگیری…………………………….. 19

2-3-12 درمان……………………………. 20

2-3-13 پیش بینی بیماری…………………………….. 21

2-3-14 بقاء هلیکوباکتر پیلوری…………………………….. 22

2-3-15 همه گیر شناسی باکتری (Epidemiology)………….. 24

2-4 آنتی ژن‌ها……………………………25

2-4-1 ساختمان آنتی ژن……………………………. 25

2-5 اپی توپ‌ها…………………………… 26

2-5-1 انواع اپی توپ‌ها…………………………… 26

2-5-2 عملکرد……………………………. 27

2-5-2-1 اپی توپ‌های سلول T……………………………..

2-5-3 واکنش متقاطع……………………………..28

2-5-4 نقشه برداری اپی توپ فضائی…………………………….. 28

2-5-5 نشانه‌های اپی توپ……………………………… 28

2-6 تحقیقات انجام شده در این زمینه……………………………. 29

2-7 ابزار‌های مورد استفاده…………………………… 38

2-7-1 دات بلاتینگ……………………………… 38

2-7- 2 نرم افزار CLC Work Bench5…………………………….

2-7-3 نرم افزار Mega5…………………………….

2-7-4 ابزار BLAST……………………………..

برای دیدن جزییات بیشتر و دانلود پایان نامه اینجا کلیک کنید

 

3 مواد و روش‌ها…………………………… 40

3-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA……………………………..

3-2 تهیه باکتری هلیکو باکتر پیلوری…………………………….. 41

3-3 استخراج DNA و تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده……41

3-3-1 تعیین کمیت و کیفیت DNA با ژل آگارز……………………. 41

3-4 تعیین غلظت DNA استخراج شده…………………………… 42

3-5 طراحی آغازگرها…………………………… 42

3-6 انجام واکنش PCR……………………………..

3-7 خالص سازی محصول PCR……………………………..

3-7-1 بررسی بر روی ژل الکتروفورز……………………………. 45

3-8 طرز تهیه محلولهای مورد استفاده در کلونینگ……………… 45

3-8-2 محلول غلیظ آنتی بیوتیک آمپیسیلین……………………. 46

3-8-3 محلول غلیظ IPTG  (0. 1M)…………………………….

3-8-4 محلول غلیظ X-Gal  (20mg/ml)…………………………….

3-8-5 محیط کشت LB مایع…………………………….. 46

3-8-6 محیط کشت LB-Agar جامد……………………………. 47

3-9-2 هضم pET-32a  (+)…………………………….

3-9-3 خالص سازی pET-32a  (+) و قطعه هدف………………… 49

3-9-4 نانودراپ محصولات خالص شده…………………………… 50

یک مطلب دیگر :

3-9-5 انجام واکنش الحاق قطعه هدف ژن CagA با pET-32a  (+)………..

3-9-6 جوان سازی باکتری DH5α……………………………..

3-9-7 تهیه سلول‌های مستعد DH5α……………………………..

3-9-8 انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری…………………………….. 52

3-9-9 کشت پرگنه‌‌ها و غربال گری باکتری های نوترکیب………………. 53

3-9-10 کلونی PCR……………………………..

3-9-11 استخراج پلاسمید نوترکیب……………………………… 54

3-9 -12 تایید کلونیها از طریق هضم آنزیمی………………………. 55

3-10 توالی یابی…………………………….. 56

3-11 انتقال پلاسمید pET-32a (+) حاوی ژن هدف به باکتری BL21 (DE3)……..

3-12 تحریک بیان ژن هدف……………………………… 56

3-13 استخراج پروتئین از باکتری…………………………….. 57

3-14 الکتروفورز پروتئینها به روش SDS-PAGE……………..

3-14-1 مراحل بستن ژل به صورت زیر انجام شد……………..59

3-15 دات بلات……………………………… 61

3-16 محلولها و بافرها…………………………… 62

3-16-1 بافر شستشو یا محلول TBS…………………………….

3-16-2 محلول بلوکه کننده…………………………… 62

3-16-3 بافر شستشو یا محلول TBS-T……………………………..

3-16-4 آنتیبادی اولیه……………………………. 62

3-16-5 آنتیبادی ثانویه……………………………. 62

3-16-6 روش تهیه محلول رنگ آمیزی DAB…………………..

3-17 خالص سازی پروتئین…………………………….64

3-18 آماده سازی آنتی ژن ایمنی زا برای تزریق به مرغ………………….. 64

3-19 ایمنی زائی مرغ‌ها جهت تولید آنتی بادی اختصاصی……………… 65

3-19-1 تزریق اولیه…………………………… 65

3-19-2 تزریق‌های ثانویه  (Booster injection)……………………………. 66

3-20 جمع آوری و ذخیره تخم مرغ……………………………. 66

3-21 جداسازی IgY با استفاده از روش پلی اتیلن گلایکول 14700……………. 66

3-22 بررسی IgY به روش الکتروفورز SDS-PAGE و دات بلات……………… 67

4 نتایج و بحث……………………………… 67

4-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA……………………………..

4-2 تایید آلودگی نمونه‌های بیوپسی…………………………….. 69

4-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA……………………………..

4-4 بررسی محصولات PCR……………………………..

4-5 خالص سازی محصول PCR……………………………..

4-6 هضم PET32a (+) و ژن CagA……………………………..

4-7 کلونینگ ژن CagA در باکتری DH5α……………………………..

4-8 تأیید صحت قطعه کلونشده در pET32a (+)………………………….

4-9 نتایج کلونی PCR…………………………….

4-10 تایید نتایج کلونی PCR با استفاده از T7…………………………….

4-11 استخراج پلاسمید و انجام هضم آنزیمی…………………………….. 75

4-12 توالی یابی…………………………….. 76

4-13 آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسیدی CagA……………………………..

4-14 بیان ژن……………………………. 78

4-15 SDS-PAGE…………………………….

4-16 دات بلات……………………………… 79

4-18 تولید IgY ضد هلیکو باکتر پیلوری-CagA در زرده تخم مرغ………… 81

5 نتیجه گیری و پیشنهادات……………………………… 85

چکیده: