عنوان:
جداسازی، تعیین هویت مولکولی وتهیه الگوی ژنومی مایکوباکتریوم های کمپلکس توبرکلوزیس ازگاوهای توبرکولین مثبت استان خراسان
استاد راهنما:
دکتر نادر مصوری
استاد مشاور:
دکتر کیوان تدین
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب صفحه
چکیده………………………………………………………………………………………………………………………………………………….1
فصل اول (مقدمه و هدف) …………………………………………………………………………………………………………………..3
1-1-بیماری سل…………………………………………………………………………………………………………………………………..5
1-2- مایکو باکتریوم ها ………………………………………………………………………………………………………………………..7
1-2-1-نامگذاری…………………………………………………………………………………………………………………………………7
1-2-2- طبقه بندی مایکو باکتریوم ها …………………………………………………………………………………………………….9
1_2_3_ مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی ………………………………………………………………………………. 11
1-2-4- خصوصیات رشد مایکوباکتریها ……………………………………………………………………………………………….12
1-2-5- فاکتورهای ویورلانس مایکوباکتریوم ها……………………………………………………………………………………..13
1-2-6- آنتی ژنهای مایکوباکتریوم ها……………………………………………………………………………………………………14
1-3- پاتوژنز ……………………………………………………………………………………………………………………………………..15
1-4- اشکال بیماری سل …………………………………………………………………………………………………………………….17
1-5- عوامل مساعد کننده ……………………………………………………………………………………………………………………17
1-6- عارضه های بیماری…………………………………………………………………………………………………………………….18
1-7- پیدایش بیماری ………………………………………………………………………………………………………………………….18
1-8- روشهای تشخیص ……………………………………………………………………………………………………………………..20
1-9- درمان ………………………………………………………………………………………………………………………………………21
1-10- عوارض داروهای ضد سل ……………………………………………………………………………………………………….22
1-11- پیشگیری ………………………………………………………………………………………………………………………………..22
1_11 _1_ پیشگیری در جامعه ……………………………………………………………………………………………………………23
1_11_2_ پیشگیری با واکسن سل………………………………………………………………………………………………………..23
1-12- اهمیت مبارزه صحیح با سل ……………………………………………………………………………………………………..23
1-13- سل گاوی……………………………………………………………………………………………………………………………….24
1-13-1-بیماری سل در گاو ……………………………………………………………………………………………………………….24
1-13-2-علائم بالینی سل گاوی…………………………………………………………………………………………………………..26
1-13-3-تشخیص بیماری سل در گاو …………………………………………………………………………………………………27
1-13-4-کنترل بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………..27
1_14_ راههای ابتلا به سل گاوی ………………………………………………………………………………………………………..29
1-15- تعیین هویت مایکوباکتریومها ……………………………………………………………………………………………………30
1_15_1_تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات فنوتیپیک ………………………………………………….30
1- 15 -2- تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات ژنوتیپی………………………………………………….35
1-15-2-1-تشخیص بیماری ……………………………………………………………………………………………………………..36
1-15-2-2- تعیین هویت مولکولی مایکوباکتری هاجهت تعیین گونه ……………………………………………………..39
1-15-2-2-1-پروب های اسید نوکلئیک ……………………………………………………………………………………………..39
1-15-2-2-2 ریبوتایپینگ ………………………………………………………………………………………………………………….39
1-15-2-2-3- روش هیبریدیزاسیونDNA – DNA ……………………………………………………………………………39
1-15-2-2-4-پروب های هیبریداسیون داخل ژنومی تجاری …………………………………………………………………40
1-15-3-ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس ………………………………………………………………………………40
1-16-تکنیک های ژنومی …………………………………………………………………………………………………………………..42
1 _16_1_تكنیكهای ژنومی كه اساس آنها PCR نمیباشد …………………………………………………………………..42
1_16_1_2_انگشتنگاری DNA به روش RFLP …………………………………………………………………………….43
1_16_2_1_اسپولیگوتایپینگ………………………………………………………………………………………………………………50
1_16_1_2_5_استفاده از مخلوط پروبها در RFLP……………………………………………………………………….. 50
1_16_2_2_ VNTR ……………………………………………………………………………………………………………………….51
فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده) …………………………………………………………………………………………55
2-1-تاریخچه بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………….56
2-2-وضعیت بیماری سل در جهان ……………………………………………………………………………………………………..58
2-3-تاریخچه سل گاوی در ایران ……………………………………………………………………………………………………….65
فصل سوم (مراحل روش تحقیق) ………………………………………………………………………………………………………70
3-1-جمع آوری نمونه ها …………………………………………………………………………………………………………………..71
3-2-مواد و تجهیزات مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………71
3_2_1_ مواد مصرفی…………………………………………………………………………………………………………………………71
3_2_2_تجهیزات مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………..73
3_2_2_2 _تجهیزات مورد نیاز برای استخراج DNA…………………………………………………………………………….73
3_2_2_3_ تجهیزات برای PCR…………………………………………………………………………………………………………73
3_2_2_4_ تجهیزات برای هضم آنزیمی………………………………………………………………………………………………74
3_2_2_5_ تجهیزات الکتروفورز DNA و ساترن بلاتینگ……………………………………………………………………..74
3_2_2_6_ تجهیزات هیبریداسیون………………………………………………………………………………………………………74
3_2_2_7_ تجهیزات آشکار سازی………………………………………………………………………………………………………74
3_2_2_8_ تجهیزات مورد نیاز برای نانودراپ………………………………………………………………………………………74
موارد روش تحقیق …………………………………………………………………………………………………………………………….74
3_3_13_4_1_تهیه گسترش از نمونه و رنگ آمیزی……………………………………………………………………………..74
3_4_1_3_تفسیر نتایج گسترش…………………………………………………………………………………………………………..76
3_4_ 2_کشت نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………………..76
3_4_2_ 1_صلایه کردن نمونه ها ………………………………………………………………………………………………….76
3_4_2_2_ آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون ……………………………………………………………………………………..76
3_4_2_3_سانتریفیوژ و خنثی سازی PH……………………………………………………………………………………… 78
3_4_2_4_ کشت در لوله های لونشتاین – جانسون حاوی گلیسیرین و پیرووات……………………………….79
3_4_3_بررسی کشت لوله های لونشتاین – جانسون ………………………………………………………………………80
3_4_4_ رنگ آمیزی به روش فلئورو کروم …………………………………………………………………………………. 80
3_4_5_ انجام تست های بیوشیمیایی تعیین هویت ………………………………………………………………………….81
3_4_5_1_تست نیاسین ……………………………………………………………………………………………………………….82
3_4_5_2_ تست کاتالاز ……………………………………………………………………………………………………………. 82
3_4_ 6_کشت مجدد در لوله لونشتاین – جانسون…………………………………………………………………………….82
3_4_7_استخراجDNA ………………………………………………………………………………………………………………..83
3_4_7_1_آماده سازی مواد مصرفی برای استخراج DNA……………………………………………………………… 83
3_4_7_2_ كنترل و جمع آوری سلولهای باكتری رشد یافته ……………………………………………………………..83
3_4_7_3_مراحل استخراج DNA ………………………………………………………………………………………………..84
3_4_8_ارزیابی كیفیت و کمیتDNAاستخراج شده………………………………………………………………………….86
3_4_8_1_ارزیابی كفیت DNA استخراج شده………………………………………………………………………………..86
3_4_8_1_1_آماده سازی مواد مصرفی جهت ارزیابی کیفی DNA استخراج شده…………………………….86
بافر تریس-بورات-EDTA یک برابر……………………………………………………………………………………………….86
بافر نمونه………………………………………………………………………………………………………………………………………86
ژل آگارز……………………………………………………………………………………………………………………………………….86
3_4_8_2_ارزیابی کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP……………………………………… 88
3_4_8_3_ PCR بر اساس پروتکل WHO………………………………………………………………………………….. 90
3-4-8-3-1مراحل PCR روی نمونه های DNA استخراج شده………………………………………………………..91
3-4-9- الكتروفورز محصولPCR……………………………………………………………………………………………….. 92
RFLP …………………………………………………………………………………………………………………………………………92
3_4_10_هضم DNA کروموزمی به وسیله آنزیم Pvu II………………………………………………………………. 93
یک مطلب دیگر :
3_4_11_جداسازی قطعاتDNA به وسیله الکتروفورز……………………………………………………………………..94
3_4_12_ ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………94
3_4_12_1_آماده سازی محلول های مورد نیاز ساترن بلاتینگ …………………………………………………………94
3_4_12_2_عمل آوری ژل قبل از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………..96
3_4_12_3_بلاتینگ به روش موئینه ……………………………………………………………………………………………….96
3_4_12_3_عمل آوری غشا بعد از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………97
3_4_13_تثبیت DNA برروی غشا ………………………………………………………………………………………………..98
3_4_14_تهیه پروب های هیبریداسیون و مک هیبریداسیون …………………………………………………………………..98
3_4_14_1_پروب PGRS ………………………………………………………………………………………………………………..99
3_4_14_2_به دست آوردن رقت مناسب برای پروبPGRS به روش مک هیبریداسیون………………………..99
3_4_15_شناسایی ……………………………………………………………………………………………………………………………100
3_4_16_دات بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………………………..101
3_4_17_پری هیبریداسیون و هیبریداسیون با پروب نشان دار با دیگوکسیژنین ……………………………………..102
3_4_17_1_مرحله پری هیبریداسیون ………………………………………………………………………………………………..102
3-4-17-2- مرحله هیبیریداسیون ………………………………………………………………………………………………………102
فصل چهارم(نتایج و بحث ) …………………………………………………………………………………………………………….104
نتایج و بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………………105
4-1- نمونه برداری ………………………………………………………………………………………………………………………….105
4-2- بررسی كشت لوله های لونشتاین– جانسون ………………………………………………………………………………..105
4-3-آزمون وجود IS6110 ………………………………………………………………………………………………………………106
4-3-1- نتایج واكنش PCR……………………………………………………………………………………………………………. 106
4-4- بررسی کمیت DNA استخراج شده برای هضم آنزیمی ((RFLP…………………………………………………..107
4-5- بررسیDNA استخراج شده ……………………………………………………………………………………………………..108
4-6- نتایج هضم آنزیمی(RFLP)، بررسی الکتروفورز و تهیه عکس……………………………………………………….109
4-7- نتایج ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………..110
فصل پنجم(نتیجه گیری و پیشنهادات) ……………………………………………………………………………………………….114
پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………………………………….125
منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126
منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………126
منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………127
فهرست جدول ها
عنوان جدول صفحه |
جدول1–1نامگذاری مایکوباکتریوم ها ……………………………………………………………………………………………………. 8 |
جدول1-2:لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونههای مختلف کندرشد مایکوباکتریای ……………. 33 |
جدول 1- 3: لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونههای مختلف سریع الرشد مایکوباکتریایی …..…………… 35 |
جدول 3-1: تعداد 65 نمونه عقدههای لنفاوی گاو ارسالی به موسسه سرم سازی رازی ……………………………….. 71 |
جدول 3-2: لیست مواد مصرفی …………………………………………………………………………………………………………… 72 |
جدول 3_3 : مواد متشکله در محیط کشت لونشتاین- جانسون ………………………………………………………………… 79 |
جدول 3-4: تستهای تعیین هویت مایکوباکتریومها ………………………………………………………………………………. 81 |
جدول 3-5: برنامه دما، زمان و چرخه ترموسایکلر ………………………………………………………………………………….. 91 |
جدول 4-1- نمونههای مورد استفاده به همراه الگوهای مشاهده شده و مکان جغرافیائی نمونهها ………………………….. 113 |
فهرست شکل ها
[پنجشنبه 1399-08-01] [ 06:45:00 ب.ظ ]
|