2-2-3- نشانه­های بیماری ویروس موزاییک هندوانه………………………………………………………………… 12

2-3- تمایز سرولوژیکی جدایه­های ویروس…………………………………………………………………………….. 13

2-4- نوترکیبی و تنوع ژنتیکی ویروس­های گیاهی…………………………………………………………………… 14

2-5- تنوع ژنتیکی ویروس موزائیک هندوانه. 16

2-6- بررسی­های صورت گرفته در مورد ویروس موزاییک هندوانه در دنیا……………………………………. 17

2-6-1- ویروس موزاییک هندوانه درایران………………………………………………………………………………. 17

2-6-2- ویروس موزاییک هندوانه در خارج از کشور………………………………………………………………. 22

فصل سوم: مواد و روش­ها

3-1- زمان و مکان تحقیق……………………………………………………………………………………………………. 34

3-2- جمع آوری نمونه­ها و داد­ه………………………………………………………………………………………….. 34

3-3- آزمون الایزا………………………………………………………………………………………………………………. 35

3-3-1- آزمون الیزای غیر مستقیم…………………………………………………………………………………………… 35

3-4- آزمون PCR………………………………………………………………………………………

3-4-1- استخراج RNA و ساخت cDNA……………………………………………………………………………………….

3-4-2- مرحله PCR………………………………………………………………………………………

3-4-2-1- آغازگرهای اختصاصی………………………………………………………………………………………. 38

3-5- روش تهیه­ی ژل و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR……………………………………

3-6- ترادف‌یابی محصول PCR………………………………………………………………………………………

3-7- تجزیه و تحلیل داده­ ها…………………………………………………………………………………….. 40

فصل چهارم: نتایج

4-1- نتایج آزمون الایزا…………………………………………………………………………………….. 42

4-2- نتایج آزمون RT-PCR………………………………………………………………………………………

4-3- تنوع ژنتیکی بین جدایه ­های WMV…………………………………………………………………………

4-4- نوترکیبی بین جدایه­ هایWMV………………………………………………………………………………..

4-5- مقایسه شباهت­ها و تفاوت­های ناحیه CP جدایه­های WMV در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی….52

یک مطلب دیگر :

6- موتیف­های موجود در جدایه WMV ………………………………………………………………………………..

 فصل پنجم: بحث

بحث………………………………………………………………………………………………………………………………… 57

پیشنهادات اجرایی و پژوهشی…………………………………………………………………………………………………. 62

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………… 63

چکیده:

ویروس موزاییک هندوانه (WMV) یکی از ویروس­های مهم جالیز است که گسترش جهانی دارد و از بسیاری از مناطق دنیا گزارش شده است. به دلیل اهمیت کشت جالیز در استان گلستان و آلودگی گسترده ویروس در این گیاهان شناخت دقیق وضعیت ویروس در منطقه مهم می­باشد. یه منظور شناسایی این ویروس، 100 نمونه از گیاهان هندوانه، خربزه، کدو و خیار با علایم مشکوک به بیماری از مزارع استان گلستان جمع‌آوری و با آنتی سرم اختصاصی WMV در آزمون الایزای غیر مستقیم مورد بررسی قرار گرفت. از گیاهان آلوده، RNA ویروس با استفاده از کیت (Roche) mRNA capture استخراج و cDNA تهیه گردید. جهت تکثیر ناحیه پروتئین پوششی ویروس از آغازگرهای اختصاصی در واکنش RT-PCR استفاده گردید. محصول PCR به طور مستقیم ترادف یابی شد و ترادف به دست آمده شامل 964 نوکلئوتید همراه با 31 ترادف انتخاب شده از GenBank مقایسه شدند. همردیف­سازی­های چندگانه و آنالیزهای فیلوژنتیک و تعیین نسبت جانشینی نامترادف (dN) به جانشینی مترادف (dS) با نرم‌افزارهای DNASTAR، DNAMAN، Clustal X وMEGA5  انجام و درخت فیلوژنتیک به روش neighbor-joining ترسیم گردید. برای آنالیز نوترکیبی بین جدایه­ها از نرم افزار RDP3 با استفاده از متد BootScan استفاده شد. در این بررسی تعداد 18 نمونه در واکنش الایزای مثبت و بقیه منفی بودند. نتایج بدست آمده از درخت فیلوژنتیکی این جدایه­ها را در 4 گروه قرار داد که همه جدایه­های استان گلستان در یک گروه و در کنار جدایه­هایی از اصفهان، شیروان، مشهد، کرمان، یزد و تعدای از کشورهای اروپایی قرار گرفتند و بیشترین شباهت را به جدایه­ای از اصفهان داشت و در میان سایر کشورها به جدایه ترکیه (6/96%) در سطح نوکلئوتیدی شبیه تر بود و در سطح آمینواسیدی بیشترین درصد تشابه را با جدایه اسپانیا (3/97%) داشت. محاسبه تنوع ژنتیکی (π) نشان داد که برای تمامی گروه­ها این میزان 061/0 می باشد. نسبت dN/dS در گروه­های فیلوژنتیک کمتر از 1 بدست آمد که نشان دهنده­ی نقش موثر انتخاب منفی در تنوع و تکامل این ویروس می­باشد. همچنین نتایج نشان داد که در میان جدایه­های ایرانی تنها یک مورد نوترکیبی وجود دارد که مربوط به جدایه یزد بوده که در ناحیه ابتدای ژن پرتئین پوششی خود ترکیبی از ترادف نوکلئوتیدی جدایه اصفهان را دارا می­باشد. اما در بین جدایه­های سایر کشورها اکثر موارد نوترکیبی در ناحیه CP ژنوم ویروس مشاهده می­شود. با این وجود می­­توان با انجام آنالیزهای اجدادی بررسی کرد که جد اصلی این ویروس مربوط به کدام منطقه جغرافیایی است و به ترادف نوکلئوتیدی کدام کشور نزدیکتر است.

فصل اول: مقدمه

1-1- گیاهشناسی محصولات جالیزی (کدو، خیار، خربزه، هندوانه)