2-4- معرفی جایگزین برای آنتی‌بیوتیک محرک رشد. 16

2-4-1- پروبیوتیك‌ها 16

2-4-1-1 – ویژگی یک پروبیوتیک.. 17

2-4-1-2 – مکانیسم عمل پروبیوتیک ها 18

2-4-1-3 – باکتری های اسید لاکتیکی به عنوان پروبیوتیک.. 19

2-4-1-4 – نقش پروبیوتیک ها در تحریک سیستم ایمنی. 19

2-4-1-5 – عوامل موثر بر قدرت بقاء میکروارگانیزم های پروبیوتیک.. 20

2-4-1-6- انتخاب سویه های مناسب برای فراورده های پروبیوتیکی. 21

2-4-2- پری بیوتیك‌ها 24

2-4-2-1- الیگوساکاریدها 25

2-4-2-1-1- اثرات الیگو ساکاریدها 25

2-4-2-1-2- مکانیسم عمل الیگو ساکاریدها : 25

2-4-3 – اسید های آلی. 26

2-4-4- مواد معدنی و نمکهای آنها 27

2-4-5- گیاهان آروماتیک (دارویی)، عصاره های گیاهان دارویی و اسانس های روغنی. 27

2-4-5-1- تاریخچه استفاده از اسانس های روغنی. 29

2-4-5- 2- نحوه عمل گیاهان آروماتیک و عصاره های آنها 31

2-5- بررسی اثرات ترکیبات گیاهی بر سیستم ایمنی طیور 32

2-6 – بررسی اثرات ترکیبات گیاهی بر عملکرد طیور 33

2-7- بررسی منابع گیاهان موجود در اولئوبیوتک.. 37

2-7-1- گیاه زنجبیل. 37

2-7-1-1- ترکیب شیمیایی. 37

2-7-1-2- خواص دارویی. 38

2-7-2- فلفل. 38

2-7-2-1- فلفل سبز، قرمز. 38

2-7-2-1-1-ترکیبات شیمیایی. 39

2-7-2-1-2- خواص دارویی. 39

2-7-2- 2- فلفل سیاه 39

2-7-2- 2- 1- ترکیبات شیمیایی. 40

2-7-2- 2- 2- خواص دارویی. 40

2-7-3- زرد چوبه(زعفران هندی) 41

2-7-3- 1- ترکیب شیمیایی. 41

2-7-3- 2- خواص درمانی. 42

2-8- عملکرد سیستم ایمنی. 42

2-8-1- سیستم ایمنی. 42

2-8-1-1- ایمنی ذاتی. 43

2-8-1-1-1- ژنتیک.. 43

2-8-1-1-2- جمعیت میکروبی. 43

2-8-1-1-3- مژه‌های سیستم تنفسی. 43

2-8-1-2- ایمنی اکتسابی. 44

2-8-1-2- 1- ایمنی هومورال. 44

2-8-1-2- 2- ایمنی سلولی. 45

2-8-2- ویژگی های سیستم ایمنی پرندگان. 45

2-8-3- بورس فابریسیوس.. 46

2-8-4- تیموس.. 46

2-8-5- مکانیسم پاسخ ایمنی. 46

2-8-6- آنتی‌بادی. 47

2-8-7- انواع ایمونوگلوبولین. 47

2-8-7-1- ایمونوگلوبولین Y.. 47

2-8-7-2- ایمونوگلوبولین M.. 48

2-8-7- 3- ایمونوگلوبولین A.. 48

2-8-8- ساختمان ایمونوگلوبولینها 48

فصل سوم: مواد و روشها

3-1 – محل انجام آزمایش… 51

3-2 – آماده سازی سالن. 51

3-2-1- برنامه نوری و دما 51

3-2-2- تهویه سالن و رطوبت.. 52

3-2-3- دانخوری و آبخوری. 52

3-2-4- برنامه واکسیناسیون. 52

3-3- توزیع جوجه ها در واحدهای آزمایشی. 53

3-4- تزریق محلول SRBC.. 53

3-5- نمونه‌گیری. 54

3-6- مدیریت دوره پرورش.. 54

3-7- پرندگان و تیمارهای آزمایشی. 55

3-8- آماده سازی مواد مورد آزمایش… 56

3-8-1- اولئوبیوتک.. 56

3-8-2- باکتوسل. 56

3-9- فرموله کردن جیره ها 56

3-10- طرح آماری آزمایش… 59

3-11- فراسنجه های مورد مطالعه و روش اندازه گیری آنها 59

3-11-1- صفات اندازه گیری شده برای عملکرد و نحوه محاسبات آنها 59

3-11-1 –1- خوراك مصرفی. 59

3-11-1 –2- میانگین افزایش وزن هفتگی. 60

3-11-1-3- ضریب تبدیل خوراک: 61

3-11-2- اندازه‌گیری سیستم ایمنی. 61

3-11-2-1 – روش انجام آزمایش HI 61

3-11-2-2- روش انجام آزمایش HA.. 61

3-11-2-3- روش انجام آزمایش HI 62

3-11-2-4- روش انجام آزمایش الایزا 62

3-11-2-5- روش انجام آزمایش SRBC.. 63

فصل چهار: نتایج

4-1- عملكرد 65

4-1-1- خوراک مصرفی. 65

4-1-2- افزایش وزن. 67

4-1-3- ضریب تبدیل غذایی. 69

4-1-4- تلفات کل. 71

4-2- سیستم ایمنی. 73

4-2-1- تیتر آنتی SRBC کل و ایمونوگلوبولینهای M و G در 28 روزگی. 73

4-2-2- تیتر آنتی SRBC کل و ایمونوگلوبولینهای M و G در 42 روزگی. 75

4-2-3- تیتر نیوکاسل و برونشیت.. 78

4-3- بررسی هزینه غذا جهت یک کیلوگرم افزایش وزن در کل دوره 80

فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادها

5-1- عملكرد 84

5-1-1- خوراک مصرفی. 84

5-1-2- افزایش وزن. 85

5-1-3- ضریب تبدیل غذایی. 86

5-2- سیستم ایمنی. 87

5-2-1- تیتر آنتی SRBC کل و ایمونوگلوبولینهای G و M در 28 و 42 روزگی. 87

5-2-3- تیتر نیوکاسل و برونشیت.. 88

5-3- نتیجه گیری کلی. 88

5-4- پیشنهادها 89

منابع. 90

چکیده

این مطالعه به منظور مقایسه تأثیر پری‌بیوتیك اولئوبیوتیک و پروبیوتیک باکتوسل بر عملکرد و سیستم ایمنی جوجه­های­گوشتی 360 قطعه جوجه یک روزه از سویه راس 308 در قالب یک طرح کاملاً تصادفی و به صورت فاکتوریل (3×3 ) شامل 9 تیمار، 4 تكرار و 10 پرنده در هر تکرار انجام شد. تیمارهای آزمایشی شامل تیمار اول: شاهد، تیمار دوم: 150 میلی­گرم در کیلوگرم الئوبیوتیک، تیمار سوم: 300 میلی­گرم در کیلوگرم الئوبیوتیک، تیمار چهارم: 150 میلی­گرم در کیلوگرم باکتوسل، تیمار پنجم: 300 میلی­گرم در کیلوگرم باکتوسل، تیمار ششم: 150 میلی­گرم در کیلوگرم اولئوبیوتیک + 300 میلی­گرم در کیلوگرم باکتوسل، تیمار هفتم: 300 میلی­گرم در کیلوگرم اولئوبیوتیک + 150 میلی­گرم در کیلوگرم باکتوسل، تیمار هشتم: 150 میلی­گرم در کیلوگرم اولئوبیوتیک + 150 میلی­گرم در کیلوگرم باکتوسل، تیمار نهم: 300 میلی­گرم در کیلوگرم اولئوبیوتیک + 300 میلی­گرم در کیلوگرم باکتوسل در جیره مصرفی جوجه­های گوشتی بود. تجزیه و تحلیل داده­ها با استفاده از نرم افزار SAS و آنالیز واریانس داده­ها با استفاده از رویه ANOVA و مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن و در سطح 05/0 انجام شد. نتایج نشان داد که مصرف خوراک، افزایش وزن و ضریب تبدیل خوراک در دوره­های مختلف پرورش تحت تأثیر تیمارهای آزمایشی قرار گرفت (05/0P<). همچنین در طی دو دوره (28 و42 روزگی) میانگین تیتر آنتی­بادی علیه گلبول قرمز گوسفند (SRBC) و ایمونوگلوبولینG وM در تیمار­های آزمایشی اختلاف معنی­داری ایجاد کرد (05/0P<). میانگین تیتر آنتی­بادی علیه ویروس واکسن نیوکاسل در مرحله اول دارای اختلاف معنی داری بود (05/0P<) اما در مرحله دوم اختلاف معنی­داری مشاهده نگردید (05/0<P). میانگین تیتر آنتی­بادی علیه ویروس واکسن برونشیت در روز 42 دارای اختلاف معنی­داری نبود (05/0<P).

واژه­های کلیدی: الئوبیوتیک، باکتوسل، جوجه‌های گوشتی، سیستم ایمنی، عملکرد

1-1 – اهمیت پرورش طیور

امروزه یكی از بزرگترین دغدغه ها و نگرانی ها از لحاظ سیاست گذاران و برنامه ریزان، تأمین نیاز های غذایی جامعه می باشد بطوریکه در تأمین مواد غذایی نه تنها به

 كمیت بلكه به كیفیت آن نیز باید توجه گردد (پوررضا و همکاران، 1386).

مواد غذایی پروتئین دار در تغذیه انسان از اهمیت زیادی برخوردار می باشد و در این میان صنعت مرغداری از شرایط و جایگاه ممتازی برخوردار است. زیرا از یك سو به لحاظ اقتصادی تولید آن بسیار مقرون به صرفه است و از سوی دیگر به سرمایه قابل توجهی نیاز نداشته و در فضایی محدود امکان پذیر است. گوشت مرغ از نظر تناسب اسیدآمینه نسبت به گوشت بسیاری از حیوانات برتری داشته و سالم تر   می باشد، از لحاظ محتوای پروتئین و چربی گوشت مرغ بترتیب بیشترین و کمترین مقدار را پس از گوشت ماهی در بین انواع گوشت های مورد مصرف دارا می باشد. میزان كلسترول گوشت مرغ بسیار پایین بوده و بیماری های مشترك بین انسان و طیور در مقایسه با نشخوار كنندگان كم می باشد . میزان مصرف گوشت مرغ در كشور های مختلف متفاوت بوده و كشورهای پرو، آرژانتین و ژاپن با مصرف سرانه بیش از بیست كیلوگرم به ترتیب در رتبه های اول تا سوم قرار دارند. در این میان ایران با مصرف سرانه 12 كیلوگرم در رتبه هفتاد و هشتم جهان است (پوررضا و همکاران، 1386).

1-2- نقش تغذیه در پرورش طیور

حدود 70 درصد هزینه تولید جوجه گوشتی مربوط به بخش تغذیه می باشد، تحقیقات زیادی در جهت بكارگیری هر چه بهتر خوراك توسط حیوان و كم كردن هزینه های مربوط به این بخش انجام شده است. جیره در تغذیه جوجه ها ی گوشتی به دو بخش مواد مغذی و مواد افزودنی تقسیم می شود. در کشور های در حال توسعه، نگرانی عمده در مورد کمبود مواد غذایی از جمله گوشت و تخم مرغ نمی باشد بلکه امنیت غذایی و سلامت آن مهم می باشد. نگرانی در مورد گیاهان و حیوانات دستکاری شده از نقطه نظر ژنتیکی در اروپا به سرعت در حال افزایش است به طوریکه استفاده آنها در سبد غذایی افراد مجاز نمی باشد. بهر حال، بسیاری از گونه های گیاهی اصلاح نژاد شده از قبیل ذرت و کنجاله سویا به عنوان خوراک در جیره های ماکیان و دیگر حیوانات در بسیاری از کشور ها استفاده می گردد ( لیسون و سامرز، 2008)[1].

1-3 – اهمیت مکمل ها و افزودنی ها در تغذیه و سلامت طیور

با در نظر گرفتن رشد جمعیت جهان و كاهش سطح زمینهای زیر كشت محصولات مورد استفاده خوراك طیور، استفاده از مكمل های غذایی در تغذیه طیور به عنوان یك راه حل در بكارگیری هر چه بهتر خوراك مد نظر قرار گرفته است. مكمل ها، موادی هستند كه به میزان خیلی كم در جیره بكار می روند. از این تركیب ها می توان ازطریق تأمین مواد مغذی كم نیاز به منظور افزایش بازده استفاده از خوراك و همچنین سلامت طیور بهره جست. آنتی بیوتیكهای محرك رشد یكی از این مكمل ها می باشند (آیدین و همکاران، 2008).

1-4- بیان مسئله

در مراکز پرورشی بزرگ طیور ، پرندگان با شرایط استرس زا ، مشکلات مربوط به بیماری و وخیم بودن شرایط زیست محیطی رو به رو هستند که این امر سبب زیان های اقتصادی زیادی به صاحبان مراکز پرورشی طیور گردیده است (لوفول کبیر،2009)[2]. با توجه به حجم وسیع سرمایه گذاری ها در این بخش و صنایعی كه در این بخش فعالیت می كنند و همچنین با اذعان به نقش و اهمیتی كه این صنعت در تغذیه بشر داشته ، طیور و پرورش آن از اهمیت ویژه ای برخوردار شده است ( لیسون و سامرز ، 2008   )[3].

در شرایط طبیعی پرورش ، فلور میکروبی دستگاه گوارش ، که در ایجاد مقاومت به عوامل بیماریزا نقش مهمی دارد از والدین و محیط به جوجه منتقل می شود . اما در سیستم صنعتی پرورش طیور ، محیط تمیز جوجه کشی و جدا سازی جوجه ها از والدین که امری اجتناب ناپذیر نیز می باشد ، تشکیل فلور میکروبی دستگاه گوارش را در جوجه ها به تاَخیر می اندازد و به همین علت جوجه ها نسبت به باکتری های بیماریزا بسیار حساس هستند (افشارمازندران و کیایی ، 1380) .

در سیستم‌های پرورشی جدید، جوجه‌های تازه از تخم درآمده تماسی با فضولات مادری نداشته و بنابراین آنتی‌ژن‌های مادری را جهت توسعه سیستم ایمنی دریافت نمی‌كنند (فولر،1989)[4]. از سویی دیگر در صنعت پرورش طیور به منظور دستیابی به میزان بالای بازده اقتصادی ، پرندگان در سیستم های پرورشی متراکم و در گله

یک مطلب دیگر :

 

دانلود پایان نامه درمورد مجازات تبعی، حقوق اجتماعی، جزای نقدی

 های با جمعیت بالا پرورش می یابند و در معرض عوامل استرس زای مختلفی قرار می گیرند که از جمله این عوامل می توان به حمل و نقل از کارخانه جوجه کشی به واحدهای پرورشی ، تراکم بالای جمعیت گله ، واکسیناسیون ، تغییرات درجه حرارت ، تولک بردن و عوامل دیگر اشاره نمود . این عوامل نیز موجب برهم زدن تعادل فلور روده و در نتیجه تضعیف سیستم ایمنی بدن پرنده و کاهش عملکرد رشد حیوان می گردند (فرخوی و نیک نفس،1375). در چنین شرایطی برای غلبه بر این عوامل، از مواد ضد میکروبی مانند آنتی بیوتیک ها استفاده می شود (معافی و یزدی،1378).

آنتی‌بیوتیك‌ها گروهی از محرک‌های رشد می‌باشند که برای یك بازه زمانی بخصوص تجویز می‌شوند. استفاده از این مواد به منظور کنترل بیماری‌ها و محرك رشد باعث بهبود رشد و بازدهی خوراك می‌شوند (والدروپ و همکاران،2003)[5]. مكانیسم عمل آنتی‌بیوتیك‌ها، ممانعت از استقرار و رشد برخی گونه‌های باكتریایی مضر است، چرا كه این گونه‌ها یا توكسین‌ تولید می‌كنند و یا برای مواد مغذی قابل دسترس با میزبان رقابت می‌كنند. با توجه به گسترش مصرف این مواد توسط پرورش دهندگان و متأسفانه ایجاد مقاومت‌های باكتریایی و وجود باقیمانده‌های آنتی‌بیوتیكی در محصولات طیور از جمله گوشت، استفاده از آن‌ها در صنعت مرغداری و دامداری بسیار محدود گردیده و یا حتی‌المقدور تحت شرایط و ضوابط خاصی مصرف می‌گردند. بنابراین پرورش دهندگان به دنبال شناسایی و جایگزینی افزودنی‌های خوراكی جدیدی می‌باشند تا بتوانند مشكلات ناشی از آنتی‌بیوتیك‌ها را كاهش دهند (فریتز و والدروپ، 2003 [6]، آید و همکاران، 2004[7]).

امروزه تحقیقات زیادی در رابطه با اثرات افزودنی های جایگزین شونده با منشاء طبیعی به جای آنتی بیوتیک ها در جیره جوجه های گوشتی صورت می گیرد (البیتاوی و همکاران، 2010)[8]. تركیبات متعددی مانند آنزیمها، اسید های آلی، پروبیوتیك ها، پری بیوتیك ها و گیاهان دارویی به منظور بهبود سرعت رشد و یا سلامتی پرندگان مورد استفاده قرار گرفته اند (پاترسون و بورخلدر، 2003)[9].

دستکاری میکروب های روده از طریق استفاده از پری بیوتیک ها و پروبیوتیک ها سبب افزایش قابلیت هضم مواد مغذی ،مقاومت به بیماری و سلامتی دام و طیور می شود. ترکیب جمیت میکروبی مطلوب روده و دفع عوامل بیماری زا به عنوان عوامل مهم بر عملکرد، سلامتی و رشد تشخیص داده شده اند(زارع شحنه و همکاران، 1386).

پری‌بیوتیک‌ها از جمله ترکیبات غیر زنده افزودنی اند و در دسته مواد مغذی قرار نمی گیرند. از این ترکیبات برای تغییر و تعادل جمعیت میکروبی، افزایش رشد باکتری های مفید و ایجاد محیط روده ای سالم جهت جذب بهتر و بیشتر مواد مغذی استفاده می شود (زارع شحنه و همکاران، 1386).

پری‌بیوتیک‌ها شامل موادی هستند که پروبیوتیک ها می توانند از آنها استفاده کنند و اثر مکملی و همپوشانی در صورت مساعد بودن تمام شرایط ایفا کنند (فولر ،1989). بوسیله آنزیم‌های دستگاه گوارش هضم نمی‌شوند و بنابراین در روده کوچک جذب نمی‌شوند، به طور انتخابی باعث افزایش یک یا تعداد محدودی از باکتری‌های مفید می‌شوند، میکروفلورهای روده‌ و فعالیت آن ها را به سود میزبان تغییر می‌دهند (جیبسون و رابرفروید، 1995 )[10] و همچنین سبب تقویت سیستم ایمنی مخاطی روده‌ای و سیستم ایمنی عمومی می‌شوند. اما اغلب تاُثیر پری بیوتیک ها بر سلامتی میزبان ، غیرمستقیم و از طریق متابولیت هایی است که به وسیله میکروفلور روده که پری بیوتیک ها را برای متابولیسم خود استفاده می کنند ، تولید می شود که برخی از این متابولیت ها شامل اسیدهای چرب کوتاه زنجیر لاکتات ، پلی آمین ها و باکتریوسین ها می باشد(پترسون و بورخولدر، 2003)[11].

رایج‌ترین پری‌بیوتیک‌ها فرآورده‌های فروکتو الیگوساکاریدی مانند الیگوفروکتوز و اینولین هستند و از دیگر پری‌بیوتیک‌ها می‌توان به مانان الیگوساکاریدها، ترانس- گالاکتوالیگوساکاریدها، گلوکوالیگوساکاریدها، گلیکوالیگوساکاریدها، لاکتولوز، لاستیتول، مالتوالیگوساکاریدها، زایلوالیگوساکاریدها، استاکیوز و رافینوز اشاره نمود(جیبسون و رابرفروید، 1995 ).

پروبیوتیك‌ها میکروارگانیزم‌های زنده‌ای هستند كه به تثبیت فلور میكروبی روده به نفع حیوان میزبان كمك كرده و بر ضد میكروارگانیسم‌های بیماری‌زا عمل می كنند (گرین و ساینسبرگ، 2001[12]، شین، 2001)[13]. مكمل‌های پروبیوتیكی به خصوص گونه‌های لاكتوباسیلوس[14] اثر مفیدی به لحاظ ایجاد مقاومت در برابر عوامل بیماری‌زا نظیر اشریشیاكلی[15] (جین و همکارن، 1998)[16]، سالمونلا[17] (پاسکال و همکاران، 1999)[18]، كامپیلوباكتر[19] و ایمریا آسرولینا (دالول و همکاران، 2003)[20] دارند.

مكانیسم پروبیوتیك‌ها در ممانعت از استقرار پاتوژن‌ها شامل رقابت برای مواد مغذی، تولید تركیبات و شرایط ضد میكروبی (اسید چرب فرار)، باكتریوسین و كاهش PH ، رقابت برای جایگاه‌های جذب اپیتلیوم روده و تحریك سیستم ایمنی است (رولف، 2000)[21]. شاید بتوان مهم ترین ویژگی پروپیوتیک ها را در این دانست که ضمن کاهش بیماری و بهبود ضریب تبدیل غذایی در دام و طیور ، هیچ گونه باقیمانده بافتی نداشته و بر خلاف پادزیست ها (آنتی بیوتیک ها ) مقاومت میکروبی ایجاد نمی کنند (میاحی و لوایی منفرد،1387).

معمولاُ فراورده های مختلف پروپیوتیکی نتایج یکنواختی نشان نمی دهند و پژوهش درباره کاربرد این فراورده ها و تعیین سطح مطلوب آنها در تغذیه دام و طیور ادامه دارد (زارع شحنه و همکاران،1386).

تجربه چند دهه اخیر نشان داده که داروهای شیمیایی با تمام کارآیی، اثرات نامطلوب فراوانی به همراه دارند و کمتر ماده خالصی وجود دارد که دارای اثرات سوء نباشد. در مقابل مواد موثر موجود در گیاهان دارویی به دلیل همراه بودن با مواد دیگر پیوسته از یک حالت تعادل بیولوژیک برخوردارند. بنابراین در بدن انباشته نشده و اثرات جانبی به بار نمی‌آورند و از این رو امتیاز و برتری قابل توجهی نسبت به داروهای شیمیایی دارند. هم چنین ثابت شده است كه برخی از اسانس‌های گیاهی دارای اثرات آنتی‌سپتیك و ضدمیكروبی (کووان، 1999)[22] و اثرات بیولوژیكی و فارماكولوژیكی متعددی هستند. گزارش شده است استفاده از گیاهان دارویی و اسانس های آنها بر ترکیب و فلور دستگاه گوارش جوجه های گوشتی اثر دارد، سیستم ایمنی را تقویت نموده و کلسترول خون را کاهش میدهد و درنتیجه عملکرد جوجه های گوشتی را بهبود می بخشد(ریتز و همکاران، 1995)[23].

ادویه ها از گیاهان معطر تولید و از زمان های باستان نه تنها به عنوان طعم دهنده و نگهدارنده در مواد غذایی بلکه به عنوان دارو برای درمان بیماران استفاده می شده اند. این مواد مدت ذخیره و نگهداری مواد غذایی را با به تاخیر انداختن اکسیداسیون چربی ها، از طریق فعالیت آنتی اکسیدانی یا با کنترل رشد میکروارگانیسم ها از طریق خواص باکتریواستاتیکی[24] و باکتریوسیدی افزایش می دهند (پرویزآبرومند و همکاران، 1389). ادویه ها و اسانس های روغنی حاصل از آن ها، به دلیل استفاده در درمان بسیاری از بیماری ها برای قرن های متمادی، همچنین سمیت کم و عوارض جانبی نادر به عنوان یک ماده سالم و کم خطر تلقی می شوند (شان و همکاران، 2007). امکان سمی بودن و اثرات جانبی منفی افزودنی های سنتتیک، افزایش مقاومت میکروبی میکروب های پاتوژنیک در برابر آنتی بیوتیک ها، همچنین افزایش تقاضای مصرف کنندگان برای غذا های طبیعی تر، موجب شده است که مردم تمایل کمتری نسبت به استفاده از مواد سنتزی پیدا کنند و در نتیجه زمینه تحقیقات گسترده ای برای جایگزین کردن آن ها با مواد طبیعی فراهم شود. در این میان مواد طبیعی بدست آمده از گیاهان به عنوان منابع امید بخشی در جهت جایگزینی با مواد سنتزی به شمار می آیند که در این رابطه گیاهان معطر(آروماتیک) دارای ترکیبات بسیار موثری هستند (سینگ و همکاران، 2004)[25].