2-2-8-2 تاریخچه کشت بافت گیاهی …………………………………………………………………………………………………………………………………15

3-2-8-2 تاریخچه کشت بافت نخود شیرین ……………………………………………………………………………………………………………………….16

3-8-2 مراحل ریز افزائی ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….16

1-3-8-2 گندزدائی سطحی بذر …………………………………………………………………………………………………………………………………………..16

2-3-8-2 قارچ کش ها و آنتی بیوتیک ها ……………………………………………………………………………………………………………………………17

3-3-8-2 الکل اتیلیک (اتانول) …………………………………………………………………………………………………………………………………………….17

4-3-8-2 ترکیبات زداینده ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………18

5-3-8-2 محیط کشت ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….18

6-3-8-2 آب …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………19

7-3-8-2 نمک های معدنی، عناصر پر مصرف و کم مصرف ………………………………………………………………………………………………..20

8-3-8-2 کربوهیدرات …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..20

9-3-8-2 ویتامین ها …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20

10-3-8-2 تنظیم کننده های رشد گیاهی ………………………………………………………………………………………………………………………….21

1-10-3-8-2 اثرات اکسین ها بر کشت بافت ……………………………………………………………………………………………………………………..21

2-10-3-8-2 اثرات سیتوکنین ها بر کشت بافت ………………………………………………………………………………………………………………..22

3-10-3-8-2 اثرات اسید جیبرلیک بر کشت بافت ……………………………………………………………………………………………………………..22

4-8-2 آگار …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….23

5-8-2 کشت ریزنمونه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..23

1-5-8-2 پرآوری شاخساره …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..23

2-5-8-2 اندام زایی مستقیم ………………………………………………………………………………………………………………………………………………..24

3-5-8-2 تشکیل کالوس ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………25

4-5-8-2 باززائی از کالوس ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………27

5-5-8-2 ریشه زایی ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..28

6-5-8-2 سازگاری ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..30

فصل سوم: مواد و روش ها

1-3 زمان و محل انجام آزمایش ……………………………………………………………………………………………………………………………………………33

2-3 تجهیزات آزمایشگاهی ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………33

1-2-3 آزمایشگاه تهیه ترکیبات مختلف، محلول های پایه و محیط های کشت ………………………………………………………………..33

2-2-3 اتاق انتقال ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….35

3-2-3 اتاق رشد …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….35

3-3 تهیه مواد گیاهی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….36

4-3 ریزنمونه های مورد استفاده …………………………………………………………………………………………………………………………………………..36

5-3 تهیه محیط کشت ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….36

1-5-3 تهیه محلول های پایه و نگهداری آنها ………………………………………………………………………………………………………………………36

2-5-3 تهیه محلول های پایه تنظیم کننده های رشد …………………………………………………………………………………………………………37

3-5-3 نحوه آماده کردن محیط کشت …………………………………………………………………………………………………………………………………37

6-3 گندزدایی و سترون سازی وسایل ………………………………………………………………………………………………………………………………….40

7-3 آزمایش اول: گندزدایی سطحی بذر ………………………………………………………………………………………………………………………………40

8-3 آزمایش دوم: جوانه زنی بذر در محیط کشت ……………………………………………………………………………………………………………….41

9-3 زیر کشت کردن ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..41

10-3 آزمایش سوم: پرآوری شاخساره از ریزنمونه جوانه های جانبی و انتهایی ………………………………………………………………….42

11-3 آزمایش چهارم: القاء تولید کالوس ………………………………………………………………………………………………………………………………42

12-3 آزمایش پنجم: آزمایش اندام زائی از کالوس ……………………………………………………………………………………………………………….44

13-3 آزمایش ششم: اندام زائی مستقیم ………………………………………………………………………………………………………………………………45

14-3 آزمایش هفتم: ریشه زایی شاخساره های تشکیل شده از کشت غیرمستقیم و کشت مستقیم ………………………………..45

15-3 آزمایش هشتم: سازگاری و انتقال به خاک …………………………………………………………………………………………………………………46

1-15-3 تهیه بستر کشت ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..46

2-15-3 سازگاری ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….46

3-15-3 انتقال به گلخانه ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47

16-3 تجزیه و تحلیل آماری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..47

فصل چهارم: نتایج

1-4 اثر نوع تیمار گندزدایی بر درصد آلودگی بذرهای کشت شده در شرایط کشت درون شیشه ای محیط کشت…………..49

1-1-4 درصد آلودگی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….50

2-4 بررسی اثر نوع محیط کشت و شرایط روشنایی بر درصد جوانه زنی بذرهای نخود شیرین………………………………………….50

1-2-4 اثر محیط کشت بر درصد جوانه زنی بذرهای نخود شیرین ……………………………………………………………………………………..51

2-2-4 اثر روشنایی بر درصد جوانه زنی بذرهای نخود شیرین ……………………………………………………………………………………………52

3-2-4 برهمکنش اثر محیط کشت و شرایط روشنایی بر درصد جوانه زنی بذرهای نخود شیرین …………………………………….52

3-4 بررسی اثر نوع محیط کشت و نوع ریزنمونه بر پرآوری شاخساره …………………………………………………………………………………53

1-3-4 تعداد شاخساره ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….54

2-3-4 طول بلندترین شاخساره ……………………………………………………………………………………………………………………………………………56

4-4 تشکیل کالوس ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….58

1-4-4 اثر محیط‏های کشت MS و B5 بر وزن کالوس ……………………………………………………………………………………………………..59

2-4-4 اثر ریزنمونه بر وزن کالوس ……………………………………………………………………………………………………………………………………….60

3-4-4 اثر نوع هورمون های بکار رفته بر وزن کالوس ………………………………………………………………………………………………………….60

4-4-4 اثر برهمکنش نوع محیط‏های کشت MS و B5 و ریزنمونه بر وزن کالوس …………………………………………………………..61

5-4-4 اثر برهمکنش محیط‏های کشت MS و B5 و هورمون بر وزن کالوس …………………………………………………………………..62

6-4-4 اثر برهمکنش نوع ریزنمونه و هورمون بر وزن کالوس ………………………………………………………………………………………………63

7-4-4 اثر برهمکنش محیط‏های کشت MS و B5، ریزنمونه و هورمون بر وزن کالوس …………………………………………………..63

5-4 اندام زایی از کالوس ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..66

1-5-4 تعداد شاخساره …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..67

1-1-5-4 اثر ریزنمونه بر تعداد شاخساره ……………………………………………………………………………………………………………………………..67

2-1-5-4 اثر محیط کشت کالوس زا بر تعداد شاخساره ………………………………………………………………………………………………………67

3-1-5-4 اثر محیط کشت اندام زا بر تعداد شاخساره ………………………………………………………………………………………………………….68

4-1-5-4 اثر برهمکنش ریزنمونه و محیط کشت کالوس زا بر تعداد شاخساره ………………………………………………………………….69

5-1-5-4 اثر برهمکنش ریزنمونه و محیط کشت اندام زا بر تعداد شاخساره ……………………………………………………………………. 70

 

6-1-5-4 اثر برهمکنش محیط کشت کالوس زا و محیط کشت اندام زا بر تعداد شاخساره ………………………………………………71

7-1-5-4 اثر برهمکنش نوع ریزنمونه، محیط کشت کالوس زا و محیط کشت اندام زا بر تعداد شاخساره…………………………72

2-5-4 طول شاخساره …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..75

1-2-5-4 اثر ریزنمونه بر طول شاخساره ………………………………………………………………………………………………………………………………75

2-2-5-4 اثر محیط کشت کالوس زا بر طول شاخساره ……………………………………………………………………………………………………….75

3-2-5-4 اثر محیط کشت اندام زا بر طول شاخساره …………………………………………………………………………………………………………..76

4-2-5-4 اثر برهمکنش ریزنمونه و محیط کشت کالوس زا بر طول شاخساره …………………………………………………………………..77

5-2-5-4 اثر برهمکنش ریزنمونه و محیط کشت اندام زایی بر طول شاخساره ………………………………………………………………….77

6-2-5-4 اثر برهمکنش محیط کشت کالوس زا و محیط کشت اندام زا بر طول شاخساره ……………………………………………….78

7-2-5-4 اثر برهمکنش ریزنمونه، محیط کشت کالوس زا و محیط کشت اندام زا بر طول شاخساره ……………………………….79

6-4 اندام زایی مستقیم ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….82

1-6-4 تعداد شاخساره …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..82

1-1-6-4 اثر ریزنمونه بر تعداد شاخساره ……………………………………………………………………………………………………………………………..82

2-1-6-4 اثر محیط کشت اندام زا بر تعداد شاخساره ………………………………………………………………………………………………………….83

3-1-6-4 اثر برهمکنش ریزنمونه و محیط کشت اندام زا بر تعداد شاخساره ………………………………………………………………………84

2-6-4 طول شاخساره ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………84

1-2-6-4 اثر ریزنمونه بر طول شاخساره ………………………………………………………………………………………………………………………………84

2-2-6-4 اثر محیط کشت اندام زا بر طول شاخساره …………………………………………………………………………………………………………..85

3-2-6-4 اثر برهمکنش ریزنمونه و محیط کشت اندام زا بر طول شاخساره ……………………………………………………………………….86

7-4 ریشه زایی ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………88

1-7-4 تعداد ریشه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………88

1-1-7-4 اثر غلظت محیط کشت بر تعداد ریشه …………………………………………………………………………………………………………………88

2-1-7-4 اثر غلظت هورمون بر تعداد ریشه …………………………………………………………………………………………………………………………89

3-1-7-4 اثر برهمکنش غلظت محیط کشت و غلظت هورمون بر تعداد ریشه …………………………………………………………………..90

2-7-4 طول ریشه ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….90

1-2-7-4 اثر غلظت محیط کشت بر طول ریشه ………………………………………………………………………………………………………………….90

2-2-7-4 اثر غلظت هورمون بر طول ریشه ………………………………………………………………………………………………………………………….91

3-2-7-4 اثر برهمکنش غلظت محیط کشت پایه و غلظت هورمون بر طول ریشه …………………………………………………………….92

یک مطلب دیگر :

8-4 سازگاری …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

1-8-4 اثر بستر کشت سازگاری بر درصد زنده مانی ……………………………………………………………………………………………………………94

2-8-4 اثر بستر کشت سازگاری بر طول شاخساره ………………………………………………………………………………………………………………95

3-8-4 اثر بستر کشت سازگاری بر طول ریشه …………………………………………………………………………………………………………………….97

فصل پنجم: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادات

1-5 بررسی گندزدایی بذرهای کشت شده در شرایط درون شیشه ای ……………………………………………………………………………..100

2-5 جوانه زنی بذر کشت شده نخود شیرین در محیط کشت …………………………………………………………………………………………..102

3-5 پرآوری شاخساره …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………102

4-5 تولید کالوس ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..104

5-5 اندام زایی غیرمستقیم (باززایی از کالوس) ………………………………………………………………………………………………………………….106

6-5 اندام زایی مستقیم ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….108

7-5 ریشه زایی شاخساره های تولید شده ………………………………………………………………………………………………………………………….109

8-5 سازگاری و انتقال …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………111

9-5 نتیجه گیری کلی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………113

10-5 پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………114

فهرست منابع ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….115

 

 

 

 

 

((فهرست جداول و شکل ها))

عنوان                                                                                                                                      صفحه

جدول 1-3 اجزاء تشکیل دهنده محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) ………………………………………………………………………..38

جدول 2-3 اجزاء تشکیل دهنده محیط کشت گامبورگ، 1968 (B5) ………………………………………………………………………………39

جدول 3-3 تیمارهای گندزدایی جهت ضدعفونی بذر ………………………………………………………………………………………………………….40

جدول 4-3 تیمارهای جوانه زنی بذر نخود شیرین در شرایط درون شیشه ای ……………………………………………………………………41

جدول 5-3 تیمارهای مختلف آزمایش پرآوری ……………………………………………………………………………………………………………………..42

جدول 6-3 تیمارهای مختلف آزمایش تولید کالوس در محیط کشت MS ………………………………………………………………………..43

جدول 7-3 تیمارهای مختلف آزمایش تولید کالوس در محیط کشت B5 …………………………………………………………………………43

جدول 8-3 تیمارهای مختلف باززایی غیرمستقیم ………………………………………………………………………………………………………………..44

جدول 9-3 تیمارهای مختلف باززایی مستقیم ……………………………………………………………………………………………………………………..45

جدول 10-3 تیمارهای مختلف ریشه زایی در محیط کشت MS ……………………………………………………………………………………….46

جدول 11-3 تیمارهای مختلف ریشه زایی در محیط کشت MSنیم قدرت ……………………………………………………………………..46

جدول 1-4 تجزیه واریانس اثرات تیمارهای گندزدایی بر درصد آلودگی بذرهای نخود شیرین ………………………………………….49

جدول 2-4 تجزیه واریانس درصد جوانه زنی بذرهای نخود شیرین تحت تاثیر محیط کشت و شرایط روشنایی ………………51

جدول 3-4 تجزیه واریانس برخی صفات اندازه گیری شده تحت تاثیر نوع محیط کشت پرآوری شاخساره و نوع ریزنمونه54

جدول 4-4 تجزیه واریانس شاخص وزن کالوس در آزمایش کالوس زایی …………………………………………………………………………..59

جدول 5-4 اثر برهمکنش نوع محیط کشت پایه، ریزنمونه و هورمون بر وزن کالوس …………………………………………………………64

جدول 6-4 تجزیه واریانس خصوصیات شاخساره نخود شیرین در اندام زایی غیرمستقیم ………………………………………………….66

جدول 7-4 اثر برهمکنش نوع ریزنمونه، محیط کشت کالوس زا و محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره ……………………..73

جدول 8-4 اثر برهمکنش ریزنمونه، محیط کشت کالوس زا و محیط کشت اندام زا بر طول شاخساره ……………………………..80

جدول 9-4 تجزیه واریانس شاخص های تعداد شاخساره و طول شاخساره تحت تاثیر تیمارهای مختلف اندام زایی مستقیم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….82

جدول 10-4 تجزیه واریانس تعداد ریشه و طول ریشه در آزمایش ریشه زایی از شاخساره ……………………………………………….88

جدول 11-4 تجزیه واریانس درصد زنده مانی، طول شاخساره و طول ریشه در آزمایش سازگاری ……………………………………94

 

 

 

 

محمد ایرانی پور

 

میخک یکی از محبوب ترین، اقتصادی ترین و مهم ترین گل های بریدنی به سبب پیوسته گلدهی و رقم های چند رنگ و منحصر به فرد می باشد. محدودیت های موجود در روش های بهنژادی سنتی (تلاقی و گزینش) و داشتن ویژگی های هتروزیگوسیتی بالا در این گیاه سبب شده است که کاربرد فنون جدید یاخته ای – مولکولی برای بهبود ویژگی های اقتصادی این گیاه ضرورت پیدا کند. این پژوهش به منظور بررسی ریزافزایی ارقام استاندارد ’ ‘Rendz-Vousو مینیاتور’Panamera‘ توسط اندام زایی مستقیم و رویان زایی بدنی، تعیین غلظت بهینه ماده گزینشگر کانامیسین و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها انجام شد. بدین منظور آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح به طور کامل تصادفی با 3 تکرار اجرا شد. در این پژوهش، از قطعه های برگ گیاهان رشد یافته در گلخانه با سن 6 تا 8 هفته و پینه برای تهیه ریزنمونه استفاده گردید. انتقال ژن gus به میخک توسط سویه LBA 4404 باکتری Agrobacterium tumefaciens دارای پلاسمید pBI121 بیان كننده ژن بتاگلوكورونیداز انجام شد. نتایج اندام زایی مستقیم نشان داد که میانگین تعداد شاخساره های نابجا برای هر دو رقم با افزایش غلظت BA به 9/0 میلی گرم در لیتر افزایش می یابد در صورتی که با NAA بیشترین تعداد شاخساره های نابجا در غلظت 3/0 میلی گرم در لیتر به دست آمده و با افزایش غلظت آن کاهش می یابد. ارزیابی تأثیر شرایط تاریکی و روشنایی بر باززایی ارقام توسط رویان زایی بدنی در مدت زمان های 30 و 60 روز نشان داد که در شرایط تاریکی مقدار پینه به دست آمده برای هر دو رقم به طور معنی داری بیش از شرایط روشنایی می باشد. نتایج تشکیل پینه و شاخساره نشان داد که رقم ’Panamera‘ بیش از رقم ’Rendz-Vous‘ به کانامیسین مقاوم است. به نظر می رسد آلودگی باکتریایی تشکیل پینه و شاخساره را به عقب می اندازد. بدون آلودگی باکتریایی تشکیل شاخساره در غلظت 50 میلی گرم در لیتر کانامیسین برای رقم ’Rendz-Vous‘ به طور کامل متوقف شد در حالی که برای رقم ’Panamera‘ این اتفاق در غلظت 100 میلی گرم در لیتر کانامیسین صورت گرفت. در بهینه سازی انتقال ژن با اگروباکتریوم تأثیر غلظت باکتری، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری و مدت زمان هم کشتی بر کارایی انتقال ژن مورد ارزیابی قرار گرفت. آزمون شیمیایی- بافتی و تجزیه PCR پیوستن ژن بتاگلوکورونیداز در شاخساره های تراریخت باززایی شده را اثبات نمود. چگالی نوری 5/0، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری به مدت 20 دقیقه و هم کشتی به مدت 3 روز سبب افزایش درصد شاخساره های تراریخت گردید. در این پژوهش رقم استاندارد ’Rendz-Vous‘ نسبت به رقم مینیاتور ’Panamera‘ کارایی انتقال ژن بالاتری نشان داد. اختلاف بین دو رقم در میزان باززایی و کارایی تراریزش به دلیل اندازه کوچکتر ریزنمونه های برگ در رقم مینیاتور ’Panamera‘ قابل توجیه است. گیاهک های باززایی شده از اندام زایی مستقیم، رویان زایی بدنی و تراریزش با اگروباکتریوم در آمیخته پرلایت و ورمیکولیت در شرایط رطوبت نسبی %95 نگهداری و سپس به گلخانه منتقل شدند. این اولین گزارش انتقال ژن به میخک در ایران می باشد.

 

 

 

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                               صفحه

فصل اول: مقدمه. 2

1-1- منشاء. 3

1-2- اصطلاح‌شناسی. 4

1-3- انواع میخك. 4

١-4- گیاه‌شناسی و ریخت‌شناسی میخك. 5

١-5- روش‌های افزایش میخك. 7

1-6- اهمیت و اهداف پژوهش. 7

فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین. 10

2-1- ریزافزایی و کشت بافت میخک. 10

2-1-1- گزینش ریزنمونه و گندزدایی سطحی آن. 10

2-1-2- ریخت زایی و باززایی. 12

2-1-3- رویان زایی بدنی. 13

2-1-3-1- تنظیم کننده های رشد. 14

2-1-3-2- محیط پینه زایی. 16

2-1-3-3- محیط ریشه زایی. 17

2-1-3-4- سن مواد گیاهی و شرایط كاشت. 18

2-1-4- مسیرهای رویان زایی بدنی. 19

2-2- انتقال ژن توسط اگروباكتریوم. 19

2-2-1- اساس ایجاد گال و پلاسمید Ti 20

2-2-2- انتقال T– DNA.. 20

2-2-3- عوامل مؤثر بر انتقال توسط اگروباكتریوم. 22

2-2-3-1- نژادگان (ژنوتیپ). 22

2-2-3-1-1- ریزنمونه های شروع كننده. 22

2-2-3-1-2- سویه باكتری. 24

2-2-3-1-3- چگالی نوری. 25

2-2-3-1-4- انگیزاننده های ژن های بیماری زا. 26

2-2-3-1-5- مدت زمان هم كشتی. 27

2-2-3-1-6- گزینش با کانامیسین. 28

فصل سوم: مواد و روش‌ها. 30

3-1- كشت بافت. 30

3-١-1- مواد گیاهی. 30

3-١-2- قسمت‌های گیاهی مورد استفاده در كشت بافت. 30

3-١-٣- گندزدایی ریزنمونه‌ها و وسایل. 31

3-١-4- آماده‌سازی ریزنمونه‌ها برای استقرار. 32

3-١-5- محیط كشت. 32

3-2- انتقال توسط اگروباکتریوم. 34

3-2-1- مواد. 34

3-2-1-1- بافر STET. 34

3-2-1-2- بافر الكتروفورز. 34

3-2-1-3- بافر CTAB.. 35

3-2-1-4- بافر TE. 35

3-2-1- 5- بافر سنجش GUS. 35

3-2-1-6- بافر بارگذاری. 35

3-2-1-7- محلول ذخیره آنتی بیوتیك كانامیسین. 36

3-2-1-8- محلول ذخیره آنتی بیوتیك ریفامپیسین. 36

3-2-1-9- محلول ذخیره آنتی بیوتیک سفاتاکسیم. 36

3-2-1-10- محلول ذخیره استوسیرینگون. 36

3-2-1-11- محلول ذخیره نفتالن استیک اسید. 37

3-2-1-12- محلول ذخیره بنزیل آدنین. 37

3-2-1-13- محیط كشت LB (Luria–Bertani) 37

3-2-1-14- سویه A. tumefaciens. 37

3-3- روش ها. 38

3-3-1- تهیه ریزنمونه. 38

3-3-2- تهیه محیط های كشت بافت گیاهی. 38

3-3-3- آغازگرها. 40

3-4- روش ها. 40

3-4-1- آماده سازی باكتری برای انجام انتقال ژن به ریزنمونه ها  40

3-4-2- استخراج DNA پلاسمیدهای نو ترکیب. 41

3-4-3- آماده سازی ریزنمونه ها و اگروباكتریوم برای انتقال ژن به میخک. 42

3-4-4- پیش آماده سازی ریزنمونه ها. 43

3-4-5- روش کار انتقال ژن به گیاه. 43

3-4-6- گزینش و باززایی گیاهان تراریخت. 44

3-4-7- استخراج DNA از بافت های گیاهی با استفاده از محلول CTAB   45

3-4-9- روش کار. 47

3-4-10- آزمون زنجیره ای پلیمراز ((PCR.. 49

3-4-11- تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR.. 51

3-4-12- آزمون شیمیایی- بافتی برای تعیین فعالیت تراریخت GUS در شاخسارههای تراریخت. 51

3-4-13- واکاوی داده ها. 52

فصل چهارم: نتایج و بحث. 54

4-1- کشت بافت. 54

4-1-1- تشکیل شاخساره نابجا از ریزنمونه های برگ ارقام استاندارد و مینیاتور میخک. 54

4-1-1-1- مواد گیاهی. 54

4-1-1-2- گندزدایی. 54

4-1-1-3- ریزنمونه ها و محیط باززایی. 55

4-2- انتقال ژن با واسطه اگروباکتریوم. 56

4-2-1- آزمایش مقدماتی. 58

4-2-1-1- گزینش با کانامیسین. 58

4-2-2- تولید گیاهان تراریخت. 61

4-2-3- تأیید گیاهان تراریخت با سنجش فعالیت GUS. 63

4-3- آنالیز PCR.. 64

4-4- تأثیر غلظت باکتری. 67

4-5- تاثیر زمان مایه زنی. 71

4-6- تاثیر مدت زمان هم کشتی بر کارایی انتقال ژن. 69

4-7- برهمكنش سه عامل چگالی نوری باکتری، مدت زمان مایه زنی ریزنمونه ها با باکتری و مدت زمان هم کشتی. 73

پیشنهادها. 77

منابع. 78

 

 

 

 

فهرست جدول­ها

 

 

عنوان                                                                                                             صفحه

جدول 1-3- مواد تشکیل دهنده محلول­های پایه محیط كشت MS.  34

 

جدول 2-3- انواع محیط های کشت مورد استفاده.. 40

جدول 3-3- مواد مورد نیاز برای استخراج DNA ژنومی 47

جدول 4-3- مواد لازم در واكنش PCR.. 51

جدول 5-3- دوره های دمایی واکنش های PCR.. 51

جدول 1-4- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریزنمونه های برگ رقم استاندارد’Rendz-Vous‘ .  57

جدول 2-4- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریز نمونه های برگ رقم ’Panamera‘.. 57

جدول 3-4- اندام زایی از ریزنمونه های برگ دو رقم میخک روی محیط دارای کانامیسین با و بدون آلودگی توسط Agrobacterium tumefaciens LBA 4404.  60

جدول4-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در تیمار چگالی های نوری مختلف باکتری.. 70

جدول 5-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در مدت زمان های مایه زنی ریز نمونه ها با باکتری.. 71

جدول6-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در مدت زمان های هم کشتی مختلف ریز نمونه ها با باکتری  74

جدول 7-4- مقایسه درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در سه عامل چگالی نوری باکتری، زمان مایه زنی با باکتری و مدت هم کشتی ریز نمونه ها با باکتری در سه سطح مختلف برای رقم ’Rendz-Vous‘  76

جدول 8-4- مقایسه درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در سه عامل چگالی نوری باکتری، زمان مایه زنی با باکتری و مدت هم کشتی ریز نمونه ها با باکتری در سه سطح مختلف برای رقم ’Panamera‛ 77

 

 

 

 

فهرست نگاره­ها

 

 

عنوان                                                                                                                 صفحه

نگاره1-3. جایگاه های برشی پلاسمید pBI121. 43

نگاره1-4- ایجاد شاخساره و پینه پس از گذشت 8 تا 10 هفته از مایه کوبی برای رقم
Rendz–Vous 63

نگاره 2-4- سنجش ژن GUS در رقم ‘Rendz–Vous‘. 64

نگاره 3-4- سنجش ژن GUS در رقم ‘Panamera‘ 65

نگاره 4-4- نتایج آزمون PCR در رقم ’Rendz–Vous‘. وجود گیاهان تراریخت میخک با جفت آغازگرهای ژن GUS برای تأیید وجود این ژن. چاهک M نشانگر kb10، چاهک 1

یک مطلب دیگر :

 

یامدهای شبکه اجتماعی:/پایان نامه درمورد رسانه اجتماعی

 کنترل منفی، چاهک 2 تا 7 نمونه های مربوط به گیاهان تراریخت و چاهک 8 و 9 مربوط به گیاهان ناتراریخت…. 66

نگاره 5-4- نتایج آزمون PCR در رقم ‘Panamera‘. گیاهان تراریخت میخک با جفت آغازگرهای ژن gus برای تأیید وجود این ژن. چاهک M نشانگر kb10، چاهک 1 کنترل منفی، چاهک 2 تا 4 نمونه های مربوط به گیاهان تراریخت و چاهک 5 تا 7 مربوط به گیاهان ناتراریخت. 67

نگاره 6-4- سنجش ژن GUS در ریزنمونه های پینه (A,B,C) و اندام های گل (D) باززایی شده در رقم ‘Rendz–Vous‘. 68

 

کوتاهه­ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6- بنزیل آمینو پیورین (6-benzyl amino-9-(tetrahyd­ropyran-2– yl)-9H-purine)	BAP
پیشبر ویروس موزائیک گل کلم (Cauliflower mosaic virus promotor)	CaMV 35S
آب دوبار تقطیر (Double distilled water)	DDW
توفوردی (2و4- دی­کلروفنوکسی استیک اسید) (2,4-dichlorophenoxy acetic acid)	2,4-D
اتیلن دی­آمین تترا استیک اسید (Ethylene diamine tetra acetic acid)	EDTA
بتاگلوکورونیداز (β-Glucuronidase)	GUS
محیط کشت لوریا – برتانی (Luria-Bertani Medium)	LB
محیط کشت موراشیگی و اسکوگ (Murashige and Skoog Medium – 1962)	MS
نفتالن استیک اسید (Naphthalene acetic acid)	NAA
ژن نئومایسین فسفوترانسفراز (Neomycin phosphotransferase gene)	nptІІ
پلی­وینیل­پیرولیدون (Polyvinylpyrolidone)	PVP
بافر سوکروز تریس اتیلن دی آمین تترا استیک اسید تریتون (Sucrose tris EDTA tritone buffer)	STET
بافر تریس بورات اتیلن دی­آمین تترا استیک اسید (Tris burate EDTA buffer)	TBE
بافر تریس اتیلن دی­آمین تترا استیک اسید (Tris EDTA buffer)	TE
DNA منتقل شونده (Transferred DNA)	T-DNA
تیدیازرون (Thidiazuron)	TDZ
وزن / حجم (Weigh / Volume)	W/V

 

2-5- تهیه ریز نمونه 10

2-6- باززایی و ریخت زایی 10

2-7- مواد مؤثره 11

2-8- رنگیزه های گیاهی 12

فصل سوم مواد و روش ها 14

3-1- زمان و مکان آزمایش 15

3-2- مواد و دستگاه ها 15

3-3- تعیین زیوایی(قوه نامیه) بذور کنگرفرنگی به منظور تهیه دانهال های سترون 15

3-4- محیط کشت 16

3-5- ضدعفونی بذرکنگرفرنگی 19

3-6- تهیه گیاهچه استریل کنگرفرنگی 19

3-7- تهیه ریزنمونه کنگرفرنگی 20

3-8- واکشت 20

3-9- تهیه محیط کشت جهت باززایی 20

3-10- صفات مورد مطالعه 20

3-11- اندازه گیری وزن تر و خشک کالوس 20

3-12- اندازه گیری کلروفیل و کارتنوئید 21

3-13- مطالعه بیوشیمیایی کالوس کنگرفرنگی 22

3-14- اندازه گیری فنل کل 22

3-15- اندازه گیری محتوای فلاونوئید 23

3-16- اندازه گیری فعالیت آنتی اکسیدانی به روش DPPH 24

3-17- اندازه گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاهHPLC 24

3-18- تهیه شکل کالیبراسیون برای اسید کلروژنیک و اسید کافئیک 25

3-19- تزریق نمونه گیاهی 26

3-20- تجزیه و تحلیل داده ها 27

فصل چهارم 28

4-  نتایج و بحث 29

4-1- نتایج مشاهده ای 29

4-2- نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل های آماری 32

4-3- نتیجه گیری کلی 77

پیشنهادات 78

منابع 79

 

 

 

فهرست جداول

جدول ‏3‑1- فرمولاسیون محیطهای کشت استفاده شده در کشت بافت گیاهی. 18

جدول ‏4‑2- اثر ساده ریزنمونه، هورمون و محیط کشت بر میزان وزن تر کالوس 32

جدول ‏4‑1- اثر متقابل ریزنمونه ، هورمون و محیط کشت بر میزان وزن تر کالوس 36

جدول ‏4‑4- اثر ساده ریزنمونه، هورمون و محیط کشت بر میزان وزن خشک (از یک گرم کالوس تر) 37

جدول ‏4‑3- اثر متقابل ریزنمونه، هورمون و محیط کشت بر میزان.وزن خشک کالوس (به ازای یک گرم وزن تر) 41

جدول ‏4‑6- اثر ساده ریزنمونه، هورمون و محیط کشت بر میزان کلروفیل a. (میلی گرم/گرم وزن تر) 42

جدول ‏4‑5- اثر متقابل ریزنمونه، هورمون و محیط کشت بر میزان کلروفیلa ، b، کل و کارتنوئید (میلی گرم/گرم وزن تر) 45

جدول ‏4‑7- اثر ساده ریزنمونه، هورمون و محیط کشت بر میزان کلروفیلb (میلی گرم/گرم وزن تر) 46

جدول ‏4‑8- اثر ساده ریزنمونه، هورمون و محیط کشت بر میزان کلروفیل کل (میلی گرم/گرم وزن تر) 49

جدول ‏4‑9- اثر جداگانه ریزنمونه ، هورمون و محیط کشت بر میزان کارتنوئید (میلی گرم/گرم وزن تر) 53

جدول ‏4‑11- اثر ریزنمونه، هورمون و محیط کشت بر درصد مهار رادیکالهای آزاد 56

جدول ‏4‑10- اثر متقابل فاکتورها بر درصد مهار رادیکالهای آزاد، فنل و فلاونوئید 60

جدول ‏4‑12- اثر ساده ریزنمونه، هورمون و محیط کشت بر میزان فنل کل (میلی‌گرم/گرم وزن تر) 61

جدول ‏4‑13- اثر ساده ریزنمونه، هورمون و محیط کشت بر میزان فلاونوئید(میلی گرم/گرم وزن تر). 64

جدول ‏4‑15- اثر ساده ریزنمونه، هورمون و محیط بر میزان اسید کافئیک 69

جدول ‏4‑14- اثر متقابل ریزنمونه، هورمون و محیط کشت بر میزان اسید کافئیک و اسیدکلروژنیک 72

جدول ‏4‑16- اثر ساده ریزنمونه، هورمون و محیط کشت بر میزان اسید کلروژنیک 73

 

فهرست اشکال

شکل ‏3‑1- گیاهچه گیاه کنگرفرنگی عاری از بیماری در محیط کشت MS2/1 19

شکل ‏3‑2- شکل استاندارد گالیک اسید 23

شکل ‏3‑3- شکل استاندارد کوئرستین 23

شکل ‏3‑4- کروماتوگرام نمونه استاندارد، اسید کلروژنیک با غلظت 50 میلیگرم در لیتر و اسید کافئیک با غلظت 7 میلی گرم در لیتر 26

شکل ‏4‑1- تغییرات کالوس در ریزنمونه دمبرگ در ماه اول کشت (چپ به راست) 29

شکل ‏4‑2- کالوس ریزنمونه های مختلف برگ (B)، دمبرگ (D) و ریشه ® 30

شکل ‏4‑3- ریشه زایی در ریزنمونه ریشه (1) و اندامزایی در ریزنمونه دمبرگ (2) و کالوسدهی جزئی در ریزنمونه دمبرگ (3) در محیط کشت فاقد هورمون 30

شکل ‏4‑4- رشد کالوس های سبز رنگ از کالوس های قهوه ای 31

شکل ‏4‑5- اثر دوگانه محیط کشت وسطوح هورمونی بر میزان وزن تر کالوس 33

شکل ‏4‑6- اثر دوگانه محیط کشت وریزنمونه بر میزان وزن تر کالوس 34

شکل ‏4‑7- اثر دوگانه سطوح هورمون وریزنمونه بر میزان وزن تر کالوس 35

شکل ‏4‑8- اثر دوگانه محیط کشت و هورمون بر میزان وزن خشک کالوس 38

شکل ‏4‑9- اثر متقابل اثر متقابل محیط کشت و ریزنمونه بر میزان وزن خشک 38

شکل ‏4‑10- اثر متقابل اثر متقابل ریزنمونه و هورمون بر میزان وزن خشک 39

شکل ‏4‑11- اثر متقابل محیط کشت و هورمون بر میزان کلروفیل a 43

شکل ‏4‑12- اثر متقابل محیط کشت و ریزنمونه بر میزان کلروفیل a 43

شکل ‏4‑13- اثر متقابل ریزنمونه و هورمون بر میزان کلروفیلa 44

شکل ‏4‑14- اثر متقابل محیط کشت و هورمون بر میزان کلروفیل b 47

 

شکل ‏4‑15- اثر متقابل محیط کشت و ریزنمونه بر میزان کلروفیل b 47

شکل ‏4‑16- اثر متقابل هورمون و ریزنمونه بر میزان کلروفیل b 48

شکل ‏4‑17- اثر متقابل محیط کشت و هورمون بر میزان کلروفیل کل 50

شکل ‏4‑18- اثر متقابل محیط کشت و ریزنمونه بر میزان کلروفیل کل 50

شکل ‏4‑19- اثر متقابل ریزنمونه و هورمون بر میزان کلروفیل کل 51

شکل ‏4‑20- اثر متقابل محیط کشت و هورمون بر میزان کارتنوئید 53

شکل ‏4‑21- اثر متقابل محیط کشت و ریزنمونه بر میزان کارتنوئید 54

شکل ‏4‑22- اثر متقابل ریزنمونه و هورمون بر میزان کارتنوئید 54

شکل ‏4‑23- اثر متقابل محیط کشت و هورمون بر در صد مهار رادیکالهای آزاد 57

شکل ‏4‑24- اثر متقابل محیط کشت و ریزنمونه بر درصد مهار رادیکالهای آزاد 58

شکل ‏4‑25- اثر متقابل هورمون و ریزنمونه بر درصد مهاررادیکال آزاد 58

شکل ‏4‑26- اثر متقابل محیط کشت و هورمون بر میزان فنل کل 61

شکل ‏4‑27- اثر متقابل محیط کشت و ریزنمونه بر میزان فنل کل 62

شکل ‏4‑28- اثر متقابل ریزنمونه و هورمون بر میزان فنل کل 63

شکل ‏4‑29- اثر متقابل محیط کشت و هورمون بر میزان فلاونوئید 65

شکل ‏4‑30- اثر متقابل محیط کشت و ریزنمونه بر میزان فلاونوئید 65

شکل ‏4‑31- اثر متقابل ریزنمونه و هورمون بر میزان فلاونوئید 66

شکل ‏4‑32- کروماتوگرام ترکیبات پلی‌فنلی کالوس کنگرفرنگی 68

شکل ‏4‑33- اثر متقابل محیط کشت و هورمون بر میزان اسید کافئیک 69

شکل ‏4‑34- اثر متقابل محیط کشت و ریزنمونه بر میزان اسید کافئیک 70

شکل ‏4‑35- اثر متقابل ریزنمونه و هورمون بر میزان اسید کافئیک 71

شکل ‏4‑36- اثر متقابل محیط کشت و هورمون بر میزان اسید کلروژنیک 74

شکل ‏4‑37- اثر متقابل محیط کشت و ریزنمونه بر میزان اسیدکلروژنیک 74

شکل ‏4‑38- اثر متقابل ریزنمونه و غلظت هورمون بر میزان اسید کلروژنیک 75

 

 

فصل اول

یک مطلب دیگر :

 

مقدمه

 

 

1-  مقدمه

 

1-1-گیاهان دارویی

در پیکر گیاهان دارویی مواد خاصی به نام «مواد مؤثره»[1] (مواد فعال[2]) ساخته و ذخیره می­شود که این مواد تأثیر فیزیولوژیکی بر پیکر موجودات زنده بر جا می­گذارند. این گیاهان برای مداوای برخی بیماری­ها مورد استفاده قرار می­گیرد. مواد فعال مذکور در طی یک سلسله فرایند­های ویژه و پیچیده بیو­شیمیایی، به مقدار بسیار کم معمولاً کمتر از وزن خشک گیاه ساخته می­شوند و به «متابولیت­های ثانویه»[3]نیز معروفند (امید بیگی، 1384). تولید متابولیت­های ثانویه بخشی از سیستم دفاعی گیاه را تشكیل می­دهد. متابولیت­های ثانویه جنبه­های مهمی از كیفیت غذای انسان )رنگ، طعم و بو( را تعیین می­كنند. برخی از آن­ها نظیر رنگدانه­های گیاهی برای تنوع گل­ها و گیاهان زینتی مهم هستند. تعدادی از متابولیت­های ثانویه گیاهی برای تولید دارو­ها، حشره­کش­ها، چاشنی­های غذایی، رنگ­ها و خوشبوكننده­ها مورداستفاده قرارمی­گیرند (حبیبی خانیانی، 1384).

 

1-2- کنگرفرنگی

کنگرفرنگی در اقتصاد کشاورزی مدیترانه با تولید سالیانه 750 میلیون تن (بیش از 60 درصد از تولید کنگرفرنگی) در بیش از 80 هکتار از زمین­های زراعی نقش قابل توجهی دارد. ایتالیا تولید کننده برجسته جهان است (در حدود 470 میلیون تن)، به دنبال آن اسپانیا (188 میلیون تن)، فرانسه (5/52 میلیون تن) و یونان (35 میلیون تن) قرار دارند (پروهنس، 2008).

 

1-2-1- مشخصات گیاهشناسی

کنگر­فرنگی با نام علمیCynara scolymus L. گیاهی است چند ساله یا پایا، سازگار با سرمای مناطق مدیترانه­ای، با طول عمر متوسط 4 سال كه ارتفاع آن به 2 متر می­رسد. دارای برگ­های بسیار بزرگ متمایل به سفید كركینه پوش وحاوی رگبرگ­های خیلی برجسته است (سید ضیایی، 1383). جوانه­های گل از قسمت انتهایی ساقه اصلی و ساقه­های جانبی گیاه بیرون می­آیند و هر جوانه گل باز نشده شبیه یک مخروط کاج می­باشد. براكته­ها دراطراف یك مركز گوشتی به­وجود می­آیند (صمصام شریعت، 1374). Cynara جنس کوچکی از خانواده کاسنی Asteraceae)) می­باشد. بومی مناطق مدیترانه­ای است که در نواحی اروپا و شمال آفریقا به صورت خودرو یافت می شود (پروهنس و همکاران، 2008). این گیاه از طریق رویشی (ساقه­های ثانویه) و همچنین با بذر و روش کشت­بافت تکثیر می­شود (پروهنس و همکاران، 2008).

 

1-2-2- ارزش غذایی و آثار فارماکولوژیکی

ارزش غذایی مربوط به ترکیبات فنلی و کربوهیدرات اینولین[4] و املاح معدنی موجود در آن است که به این گیاه طعم و مزه ویژه­ای می­دهد. ترکیبات فنلی از مشتقات اسید کافئیک[5] است. از عصاره آن ماده سینارین[6] به دست می­آید که در درمان ناراحتی­های کبدی و متابولیسم کلسترول به کار می­رود (پیوست، 1384). ترکیبات شیمیایی برگ كنگرفرنگی مورد مطالعه قرار گرفته­اند و محققان دریافته­اند که برگ­ها منبع قوی مواد پلی فنولی مثل ترکیبات کافئولکوئینیکی و فلاونوئیدی است (ماتز و هونرمیر، 2008). محققین ایتالیایی ازسال 1950تا 1980تركیب سینارین (ماده مؤثركنگرفرنگی) را به عنوان محرك كبد و مثانه وكاهش دهنده غلظت كلسترول خون به بیماران تجویز می­كردند ( فلاح حسینی و همکاران، 1384). سینارین و کلروژنیک اسید در جوانه­های گل، بذر­های جوانه زده، برگ­ها و تمام گیاه شناسایی شده است و ترکیبات فنلی گنگرفرنگی علاوه بر خاصیت آنتی­اکسیدانی، فعالیت ضد باکتریایی نیز دارند (تراجتنبرگ و همکاران، 2006).

 

1-3- بیوتكنولوژی

علم بیوتكنولوژی ازطریق كشت سلول، بافت یا ریزنمونه، در شرایط درون شیشه­ای[7]فرصتی را فراهم می­كندتا تركیب مورد نظر به دست آید. كشت سلولهای گیاهی یك منبع مناسب ومهم برای تولید متابولیت­های ثانویه با ارزش در اكثر گیاهان است. سلول­های گیاهی از نظر بیوسنتزی خاصیت توتیپتانسی[8] دارند بدین معنی كه هر سلول تحت كشت، تمام طلاعات ژنتیكی گیاه والد را دارا است و از این رو این توانایی را دارد تا دامنه­ای از مواد شیمیایی را كه در گیاه والدینی یافت می­شود تولید نماید (حبیبی خانیانی،1384).

 

1-4- فرضیات

-بین محیط­های کشت مختلف تفاوت معنی­داری در میزان کالوس وجود دارد.

-میزان ترکیبات فنولی تحت تاثیر نوع ریزنمونه و اجزاء تشکیل دهنده محیط کشت قرار دارد.

 

1-5- اهداف

-مقایسه محیط­های کشت مختلف از لحاظ تولید کالوس در گیاه گنگرفرنگی.

-بررسی میزان تولید کالوس از ریزنمونه­های تهیه شده از بخش­های مختلف گیاه.

-ارزیابی ترکیبات فنولی در کالوس­های تولید شده از قسمت­های مختلف گیاه.

 

2-1-2- تولید فایتوتوکسین توسط Pss 7

2-1-3- دامنه میزبانی 7

2-1-4- بیماریزایی P. syringae 8

2-2- آرابیدوپسیس 9

2-3- واکنش Real-time RT-PCR 10

2-3-1- بیان ژن (Gen Expression) 11

2-4- دفاع در گیاهان 11

2-4-1- مقاومت ساختاری و القایی 12

2-4-2- مقاومت سیستمیک اکتسابی Systemic Aquired Resistance (SAR) 14

2-4-3- مقاومت سیستمیک القایی Induced Systemic Resistance (ISR) 17

2-4-4- پاسخ دفاعی 18

2-4-5- سیگنال های موجود در مقاومت به بیماری های گیاهی 18

2-4-6- تشخیص الیسیتورهای باکتریایی توسط سلول های گیاهی 21

2-4-7- همکنش گیاه- Pseudomonas syringae 24

2-4-8- تغییرات در سطح سلول 26

2-5- نقش دفاعی هورمون ها در گیاهان 27

2-5-1- هورمون سالیسیلیک اسید 29

2-5-2- هورمون جاسمونیک اسید 29

2-5-3- هورمون اتیلن 29

2-5-4- هورمون آبسیزیک اسید 30

2-5-5- هورمون اکسین 31

2-6- همکنش مسیر های هورمونی (Cross-talk) 32

2-6-1- اثر آنتاگونیستی SA بر سیگنالینگ JA 36

2-7- القاگرهای شیمیایی دفاعی در گیاهان 37

2-8- بررسی تعدادی از ژن های مرتبط با دفاع در گیاهان 38

2-8-1- ژن PDF1.2 38

2-8-2- ژن VSP2 38

2-8-3- ژن LOX2 39

2-8-4- ژن PR1 40

2-9- ملاحظات 40

فصل سوم: مواد و روش ها 42

3-1- تهیه باکتری Pss 43

3-1-1- خالص سازی باکتری 43

3-1-2- آزمون تولید لوان 43

3-1-3- آزمون تولید رنگ فلورسنت 44

3-1-4- آزمون اکسیداز 44

3-1-5- آزمون واکنش فوق حساسیت (HR) 44

3-1-6- اثبات بیماری زایی روی گیاه گوجه فرنگی 44

3-1-7- آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) 45

3-2- کاشت گیاه آرابیدوپسیس 47

3-2-1- محیط کشت آرابیدوپسیس 47

3-2-2- شرایط گلخانه 48

3-2-3- مایه زنی با Pss 49

3-2-4- نمونه برداری 49

3-3- بررسی میزان جمعیت باکتری Pss 50

3-4- استخراج DNA 51

3-4-1- طرز تهیه بافر CTAB 52

3-4-2- تهیه کلروفرم- ایزوآمیل الکل 52

3-5- استخراج RNA از بافت 52

3-5-1-تهیه آب تیمار شده با DEPC 53

3-5-2- تعیین کمیت و كیفیتRNA 54

3-5-3- تیمار DNase 54

3-5-4- توقف تیمار DNase 54

3-5-5- سنتز رشته اول cDNA با استفاده از RNA استخراج شده 55

3-5-6- تکثیر قطعه مورد نظر با استفاده از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز 56

3-5-7- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده برای بررسی بیان ژن ها 57

3-6- واكنش Real-time RT-PCR (Relative) 57

3-6-1- واكنش Real-time RT-PCRژن های مقاومت و ژن كنترل داخلی 58

3-6-2- روش نرمال سازی نسبی بیان ژن ها 59

3-6-3-آنالیز آماری بیان ژن ها 59

فصل چهارم: نتایج 60

4-1- آزمون های تشخیصی اولیه 61

4-1-1- استفاده از PCR جهت تشخیص Pss 62

4-2- بررسی جمعیت باکتری پس از مایه زنی 62

4-3- استخراج Total RNA از بافت گیاه 64

4-3-1- تعیین کیفیت Total RNA 64

4-3-2- تعیین غلظت Total RNA با استفاده از نانودراپ 64

4-3-3- تیمار DNase 65

4-3-4- بررسی صحت سنتز cDNA 66

برای دیدن جزییات بیشتر و دانلود پایان نامه اینجا کلیک کنید

 

4-5- بررسی بیان ژن ها 66

4-5-1- ژن PR1 67

4-5-2- ژن VSP2 68

4-5-3- ژن PDF1.2 70

4-5-4- ژن LOX2 71

4-5-5- الگوی بیان ژن ها در دو فاز مختلف رویشی و زایشی گیاهان آرابیدوپسیس 73

فصل پنجم: بحث 75

5-1- بحث 76

5-2- بررسی دفاع ذاتی وابسته به هورمون های سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید 77

5-3- آنالیز مقایسه ای تغییرات بیان ژن ها 79

3-۵-1- بررسی پاسخ ژن PR1 علیه Pss 79

3-۵-2- بررسی پاسخ ژن PDF1.2 علیه Pss 81

5-3-3- بررسی پاسخ ژن LOX2 علیه Pss 82

3-۵-4- بررسی پاسخ ژنVSP2 علیه Pss 83

5-4- تعیین جمعیت باکتری 84

5-5- نتیجه گیری نهایی 85

5-5-1- دو فرضیه احتمالی برای بیان مسیر وابسته به JA بلافاصله بعد از مسیر وابسته به SA 86

پیشنهادات 90

منابع 91

 

 

 

 

 

فهرست شکل ها

عنوان                               صفحه

شکل 3-1- کاشت گیاهان آرابیدوپسیس در سیستم هیدروپونیک 49

شکل 4-1- انجام واکنش HR در گیاه توتون و شمعدانی وآزمایش بیماریزایی در گیاه گوجه فرنگی 61

یک مطلب دیگر :

شکل 4-2- الکتروفورز محصول PCRتشخیصی با استفاده از جفت آغازگرهای B2 و B1 62

شکل 4-3- بررسی جمعیت باکتری در زمان های نمونه برداری پس از مایه زنی در دو فاز مختلف رویشی و زایشی 63

شکل 4-4- الکتروفورز Total RNA استخراج شده از بافت ها 64

شکل 4-5- طیف جذب نوری Total RNA استخراج شده با استفاده از نانودراپ 65

شکل 4-6- الکتروفورز محصول PCR بعد از تیمار DNase 65

شکل 4-7- الکتروفورز محصول PCR پس از سنتز cDNA 66

شکل 4-8-تغییرات بیان ژن PR1 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 68

شکل 4-9- تغییرات بیان ژن VSP2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 69

شکل 4-10-تغییرات بیان ژن PDF1.2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 71

شکل 4-11-تغییرات بیان ژن LOX2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 72

شکل 4-12- الگوی تغییرات بیان ژن ها در فاز رویشی گیاهان 74

شکل 4-13- الگوی تغییرات بیان ژن ها در فاز زایشی گیاهان 74

 

 

فهرست جداول

عنوان                                           صفحه

جدول 3-1- نوع و مقدار مواد لازم برای انجام واکنش 25 میکرولیتری PCR جهت تشخیص Pss 45

جدول 3-2- سیکل دمایی PCR با آغازگرهای B1-B2 برای تشخیص Pss 46

جدول3-3- نوع و مقدار عناصر غذایی محیط کشت هوگلند 48

جدول 3-4- مقادیر و نوع مواد مورد نیاز برای تهیه 100 میلی لیتر بافر CTAB 52

جدول 3-5- نوع و مقدار مواد مورد نیاز برای تیمار DNase 54

جدول 3-6- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز رشته اول cDNA در مرحله اول 55

جدول 3-7- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز رشته اول cDNA در مرحله دوم 55

جدول 3-8- نوع و مقدار مواد لازم برای انجام یک واکنش 20 میکرولیتری PCR 56

جدول 3- 9- سیکل دمایی PCR با آغازگر ef1-α 56

جدول 3-10- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده برای بررسی بیان ژن ها 57

جدول 3-11- سیكل دمایی مورد استفاده در واكنش Real-time RT-PCR 58

جدول3-12- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واكنش 20 میکرولیتری Real-time RT-PCR برای ژن های اصلی و كنترلی داخلی 58

جدول 4-1- مقایسه میانگین جمعیت باکتری Pss در دو فاز مختلف زایشی و رویشی 63

جدول 4-2- مقایسه میانگین بیان ژن PR1 67

جدول 4-3- مقایسه میانگین بیان ژن VSP2 68

جدول 4-4- مقایسه میانگین بیان ژن PDF1.2 70

جدول 4-5- مقایسه میانگین بیان ژن LOX2 71

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل اول

 

 

یک مطلب دیگر :