انتقال وکتورهای بیانی به هانسونلا پلی مورفا…………………………………………………………………………12

جداسازی سویه های نوترکیب…………………………………………………………………………………………….12

تنظیم متابولیسم متانول……………………………………………………………………………………………………….12

فاکتور محرک رشد کلنی (G-CSF)…………………………………………………………………………………….13

ژن gcsf………………………………………………………………………………………………………………………….13

پروتئین GCSF………………………………………………………………………………………………………………..13

عملکرد پروتئین GCSF…………………………………………………………………………………………………….14

 

فصل دوم مواد و روش ها

میکروارگانیسم های مورد استفاده………………………………………………………………………………………..17

محیط های کشت مورد نیاز………………………………………………………………………………………………..17

پلاسمیدهای مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………..18

آنزیم ها و کیت ها……………………………………………………………………………………………………………18

آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………………………………18

الکتروفورز افقی محصول PCR و یا نمونه DNA بر روی ژل آگارز………………………………………….19

تخلیص محصول هضم آنزیمی با استفاده از کیت تخلیص از ژل آگارز……………………………………..19

واکنش لیگاسیون قطعات تخلیص شده…………………………………………………………………………………20

تهیه سلول های مستعد ‘E. coli TOP10F به روش تیمار با کلرید کلسیم…………………………………..20

انتقال پلاسمید به سلول های مستعد……………………………………………………………………………………..21

 

بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع………………………………………………………………………………21

PCR بر روی کلنی های باکتریایی/مخمری…………………………………………………………………………..22

استخراج پلاسمید در مقیاس کم………………………………………………………………………………………….22

استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد………………………………………………………………………………………..23

الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید(SDS-PAGE)………………………………………………..24

سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..29

PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf……………………………………………………………………………………….30

کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا………………………………………………………………………31

هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf………………………………………………………………………………………….32

هضم آنزیمی وکتوربیانی  pHan…………………………………………………………………………………………33

کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan………………………………………………………………………33

بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf……………………………………………………………………………….34

هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf…………………………………………………………………………………………35

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf……………………………………………..35

PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین……………………………………………………………………35

کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy………………………………………………….37

بررسی کلون های نوترکیب pGEM-zeo……………………………………………………………………………..38

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf………………………………………………39

هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo……………………………………………………………………39

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی تیمار شده با آلکالین فسفاتاز pHan-gcsf………40

یک مطلب دیگر :

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41

انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا…………………………………41

هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41

الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………..42

تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین………………………..43

بیان پروتئینGCSF  در هانسونلا پلی مورفا…………………………………………………………………………..44

کشت سلولهای مخمری……………………………………………………………………………………………………..44

بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE………………………………………………………………44

تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش………………………………………………………………………………………..45

ایمونوبلاتینگ…………………………………………………………………………………………………………………..46

 

فصل سوم نتایج

سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..49

PCR  اختصاصی بر روی ژن gcsf………………………………………………………………………………………49

طراحی پرایمر های اختصاصی ژن gcsf……………………………………………………………………………….49

بهینه سازی واکنش PCR برای ژن gcsf……………………………………………………………………………….50

کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا………………………………………………………………………51

هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan……………………………………………….51

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf…………………………………………………………………………………52

بررسی کلونها به روش سریع……………………………………………………………………………………………..52

انجام PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf……………………………………………………52

هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf…………………………………………………………………………..53

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf……………………………………………..54

PCR  اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble)…………………………………………………….54

کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy………………………………………………….55

تأیید کلون های نوترکیب pGEM-zeocin……………………………………………………………………………55

بررسی سریع کلونهای نوترکیب…………………………………………………………………………………………..55

هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM-zeo با BglII……………………………………………………………56

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf………………………………………………57

بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin……………………………………………………………………57

بررسی سریع کلونهای نوترکیب…………………………………………………………………………………………..57

بررسی کلونها به روش Colony-PCR…………………………………………………………………………………58

برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo………………………………………………………………………58

انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا…………………………………59

هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا………………………………….59

تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسین……………………………………….59

بیان پروتئینGCSF  در هانسونلا پلی مورفا………………………………………………………………………….60

تأیید پروتئین نوترکیب تولید شده با روش Immuno-Blotting……………………………………………….61

فصل چهارم :بحث و پیشنهادات

رویکرد کلی پژوهش…………………………………………………………………………………………………………63

فصل پنجم : منابع و پیوست

1-2-6-2 دسته بندی پروتئازها. 17

1-2-7 کاربرد پروتئازها 22

1-2-7-1 صنعت شوینده. 22

1-2-7-2 صنعت چرم. 23

1-2-7-3 صنایع دارویی.. 24

1-2-7-4 صنایع غذایی.. 25

1-2-8 سراشیا مارسسنس… 26

1-2- 9 سراشیاپپتیداز و اهمیت آن. 28

1-2-10 روشهای DNA نوترکیب و اهمیت آن. 29

1-2-11 انتخاب میزبان بیان ژن. 30

1-2- 12راهبردهای نسخه برداری (انتخاب حاملین بیان ژن) 31

 

1-2-13 سیستم بیانpET.. 32

1-2-14استراتژی خالص سازی محصول نوترکیب.. 34

هدف از انجام پروژه 36

فصل دوم: پیشینه پژوهش

2-1 ادبیات و سوابق مربوطه…39

فصل سوم: روش شناسی

3-1مواد شیمیایی.. 42

3-2 میكروارگانیسم ها ومحیط های كشت مورد استفاده 43

3-2-1 میكروارگانیسم ها و پلاسمیدها. 43

3-2-2محیط های كشت میكروبی.. 44

3-3 روش سنجش فعالیت پروتئاز. 45

3-4 مطالعات اولیه آنزیم شناسی.. 46

3-4-1 اثر دما بر پایداری آنزیم.. 46

3-4-2 اثر pH بر پایداری آنزیم.. 46

3-4-3 دمای بهینه. 47

3-4-4 تعیین پارامترهای سینتیكی آنزیم.. 47

3-5 جداسازی باکتری.. 48

3-5-1 استخراج  DNAژنومی.. 48

3-5-2 طراحی پرایمر و انجام PCR… 48

3-5-2-1 مراحل PCR ………..49

3-5-3 کلون سازی ژن سراپپتیداز در وکتورT/A  . 50

3-5-4 رسم درخت فیلوژنتیک…. 51

3-5-5 تعیین توالی ژن کدکننده سراپپتیداز. 51

3-6 روشهای الکتروفورزی.. 53

3-6-1 SDS-PAGE.. 53

3-6-2 الکتروفورز ژل آگارز(100). 53

3-7 فنون مربوط به DNA نوتركیب.. 54

3-7-1 ساختار ناقل كلونینگ…. 54

3-7-2 آماده سازی قطعهDNA  برای انتقال به درون وكتور. 55

یک مطلب دیگر :

3-7-3 استخراج DNA از روی ژل.. 56

3-7- 4 مراحل کلون مجدد. 56

3-7-5 مستعدکردن باکتری  DH5αبه روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0). 58

3-7-6 انتقال محصول الحاق به درون باکتری مستعدDH5α . 59

3-8 بافرCracking. 60

3- 9بیان ژن سراپپتیداز و تعیین خلوص آن توسطSDS-PAGE 62

3-9-1 القاء باکتری و بیان پروتئین های نوترکیب… 62

3-9-2 بررسی بیان پروتئین های نوترکیب با استفاده از روش الکتروفورز. 63

3-10 تخلیص پروتئین های نوترکیب.. 66

3-10-1 بافرهای موردنیاز تخلیص پروتئین نوترکیب… 66

3-10-2 روش تخلیص پروتئین نوترکیب… 67

فصل چهارم: تجزیه وتحلیل داده ها

4-1 جداسازی باکتری.. 70

4-2 استخراج  DNAژنومی.. 70

4-3 رسم درخت فیلوژنتیکی.. 70

4-4 کلون کردن ژن سراپپتیداز در حامل بیانیpET28-a (+) 71

4-5 بیان و تخلیص ژن سراپپتیداز نوترکیب.. 75

4-6 منحنی استاندارد. 77

4-7  اثر pH روی فعالیت آنزیم. 77

4-8 دمای بهینه آنزیم. 78

4 -9 بررسی خصوصویات کاتالیتیک آنزیم……79

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1 نتیجه گیری نهایی.. 88

5-2 پیشنهادات.. 88

منابع و مأخذ. 89

فهرست منابع انگلیسی….89

فهرست جداول

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

جدول 3-1 خصوصیات انواع سویه ها و پلاسمیدهای مورد استفاده در پژوهش …………………………………43

جدول 3-2 نسبت های واکنش الحاق …………………………………………………………………………………………..57

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

شکل 1-1 سیستم بیان pET ……………………………………………………………………………………………………….34

شکل 2-1 ناقل کلونینگPet28a…………………………………………………………………………………………………55

شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی رسم شده با استفاده از NCBI…………………………………………………………..71

شکل 4-2 الکتروفورز محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………72

شکل 4-3 الکتروفورز پلاسمید های استخراج شده از باکتریهای ترانسفورم شده توسط روش Cracking………………………………………………………………………………………………………………………………..73

شکل 4-4 نمونه های پلاسمیدی حاوی ژن…………………………………………………………………………………….74

شکل 4-5 محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………75

شکل 4-6 ژل الکتروفورز آنزیم تخلیص شده ………………………………………………………………………………..76

ت عدلیه به مدعی العموم محول گردید.این نهاد بعد از انقلاب  اسلامی تا تدوین قانون تشکیل دادگاههای عمومی و انقلاب به حیات خود ادامه و با تصویب این قانون نظام دادسرا و به تبع آن دادستان از سازمان قضایی کیفری ایران حذف شوند.اما با اصلاح دوباره در این ماده این نهاد احیاء شد.
«بند الف ماده3 اصلاحی قانون تشکیلات کیفری عدلیه ایران بیان می کند،دادسرا عهده دار کشف جرم تعقیب متهم به جرم اقامه دعوی از جنبه حق الهی و حفظ حقوق عمومی و حدود اسلامی اجرای حکم و همچنین رسیدگی به امور حسبیه وفق ضوابط قانونی است و به ریاست دادستان می باشد…..»

 

وظایف دادستان همان وظایف دادسرا می باشد به عبارت دیگر در هر موردی که قانونگذار برای دادسرا وظایف و تکالیفی تعیین نمود. همان امر از وظایف دادستان می باشد که می تواند وظایف خویش را راساً انجام و قسمتی از آن را برعهده معاونان یا دادیاران تحت مجموعه خویش محول کند.
اکنون دوازده سال از قانون احیاء گذشته  به دنبال آن اکنون قانون آیین دادرسی کیفری مصوب 92 که در جهت تکمیل قانون 81 آمده که اختیارات دادستان در این قانون نسبت به قوانین گذشته افزایش یافته تا دادستان در مقام حامی منافع جامعه، بهتر از گذشته بتواند نقش خود را ایفا کند

اهداف تحقیق
1- آشنایی مردم و قضات دادگاهها با تکالیف دادستان
2- آشنایی با نقش و اختیارات دادستان در زمینه پیگیری جرایم در قوانین موضوعه
در این تحقیق برآنیم تا به بررسی جایگاه دادستان در قانون آیین دادرسی کیفری بپردازیم. که در این راستا سوالاتی ذهنمان را به کنکاش وا می دارد که عبارتند از :
1- وظایف و اختیارات دادستان در قانون کیفری تا چه میزان حقوق متهمین و بزه دیدگان را تأمین کرده است؟
2 -بر نظارت و ریاست دادستان بر تمامی مقامات قضایی دادسرا چه پیآمدهایی مترتب است.
3-مبنای تحولّات نقش دادستان در امور کیفری چه بوده ؟

یک مطلب دیگر :

با توجه به سوالات ذکر شده فرضیه – های زیر قابل بیان است:
1- از بین بردن عدالت تحت هر عنوان اختیاری نخواهد بود.
2- نظارت وریاست دادستان بر مقامات تحقیق تعارضی با اصل استقلال مقامات تحقیق از مقام تعقیب  ندارد.
3-قضا زدایی و جلوگیری از تراکم پرونده های کم اهمیت در محاکم کیفری مبنای تحولات نقش دادستان در امور کیفری بوده است.

پیشینه تحقیق:

یک مطلب دیگر : هر آنچه لازم است در مورد تگ های NFC بدانید پایان نامه

شیوه و مفیدترین آن، ضمن توجه به عواقب تصمیم­گیری­ها، به گونه­ای با این پدیده شوم برخورد می­کرد که ضمن جلوگیری از بروز تنش­های احتمالی در آینده، تا حد ممکن راه گسترش سوء مصرف مواد مخدر را سد کند. از این رو، قوه مقننه با لحاظ همه جوانب تصمیم گرفت بررسی مشکل مواد مخدر در نخستین دوره قانون­گذاری مسکوت بماند و تصمیم­گیری به دوره بعد موکول گردد که در سال 1289 نخستین «قانون تحدید تریاک» به تصویب مجلس شورای ملی رسید اکنون بیش از یک قرن از مبارزه با قاچاق و سوء مصرف مواد مخدر، در سطوح ملی، منطقه­ای و جهانی می­گذرد.در این میان کشور ایران که بر اثر موقعیت جغرافیایی درگیر قاچاق و ترانزیت مواد مخدر از کشورهای همسایه شرقی، به ویژه افغانستان به مسیر بالکان بوده و هست، اکنون گرفتار قاچاق مواد مخدر صنعتی به داخل کشور هم شده که آشنایی ناکافی با

 انواعی از این مواد، کشف آنها را با اشکال بیشتری روبه­رو کرده است .[8]آمارها نشان می­دهد نزدیک به یک میلیون نقر در افغانستان به دلیل فقر و نبود شغل در کار کشت و تولید خشخاش فعالیت دارند[9] و افزون بر تولید عمده تریاک جهان، بیش از 26 درصد هروئین و 42 درصد کوکائین جهان نیز در این کشور تولید می­شود. ضمنا

یک مطلب دیگر :

پایان نامه تعدیل قیمت سهام/بازده کمی

 بر اساس گزارش UNODC،ارزش کل تجارت مواد مخدر جهان در سال 2006، بیش از 320 میلیارد دلار بوده است . در این بین شبکه­های قاچاق، عمده­فروشی و حمل و نقل، ده­ها برابر ارزش افزوده­ای که نصیب زارعان افغانستان می­شود، سود می­برند. بنابراین در زنده نگه داشتن سازوکار تولید و مصرف و قاچاق فعال­اند. فقر گسترده و بیکاری، به ویژه در مناطق شرقی ایران، شمار زیادی قاچاقچی خرده­پا و همکار برای جابه­جایی می­سازد. برآورد­های مربوط به خسارت مواد مخدر در ایران بر حسب روش به متوسط سالیانه شش میلیارد دلار می­رسد. به طور متوسط بر اساس آمار، سالیانه حدود 200 نفر از اعضای نیروی انتظامی کشور در جریان مبارزه با مواد مخدر به قتل می­رسند، و حدود 200 تن مواد مخدر کشف می­شود. چیزی حدود 700 تا 750 نفر از قاچاقچیان و حاملان نیز به قتل می­رسند یا اعدام می­شوند.این ارقام همچنین از نابسامانی­های شدید اجتماعی حکایت دارند. هزینه­های اجتماعی شامل معتادان، از کار افتادگان، هزینه­های اقتصادی و از همه مهم­تر قبول مجازات اعدام و برخورد خشونت­بار با قربانیان از یک سو و عاملان غیرقابل کنترل از دیگر سو در کشور بسیار بالا است که این مقدار هزینه سنگین کاملا غیرقابل دفاع است افزون بر اینها، در دهه گذشته جمع وسیعی از داروها و پیش­سازها، استفاده­ای فراگیر و عمومی یافت که از یک سو در پیمان­نامه­های 1961، 1971 و 1988 مدنظر قرار نگرفته و از سوی دیگر از سال 1338 به بعد، قانون­گذار ایران به اصلاح آن اقدام نکرده است. این موضوع سبب شیوع مصرف استروئیدهای آنابولیک، قرص­های هیجان­آور از جمله اکستاسی، داروهای آرام بخش و سایر داروهای جدیدی که در قانون سابق جرم­انگاری نشده، گردید که در حال حاضر موجب بروز آسیب­های جدی شده­اند .[10]در این میان یكی از مهمترین آسیب های موجود مشكلات و نقص هایی می باشد كه در سیستم پاسخ دهی جنایی كشور در قبال عرضه و ورود مواد مخدر وجود دارد و در هر دوره نیز با تصویب قوانین جدید و راهكارهای نامناسب به این مشكلات افزوده می شود در این پژوهش مسئله اصلی تحقیق شناساسیی این روندهای نامناسب و پیشنهاداتی در جهت اصلاح این مسائل می باشد.

ب:اهمیت و ضرورت پژوهش: