2-4- محیط کشت باکتری‏ها…………………………………………………………………….26

2-5- آنتی‏بیوتیک‏ها……………………………………………………………………………27

2-6- طراحی آغازگر………………………………………………………………………….27

2-7- شناسایی و جداسازی باکتری Xcc…………………………………………………………………………………….29

2-8- خالص سازی DNA ژنومی باکتری Xcc سویه‏ی ………………………..NIGEB.088(A*)31

2-9- تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده……………………………………………….31

2-10- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم‏هایTaq  و Pfu دی.ان.آ پلیمراز جهت جداسازی ژن‏های هدف……………………………………………………………………………………………………………………………………..31

2-11- الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………33

2-12- خالص‏سازی محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………………….33

2-13- جداسازی محصول PCR و یا محصول حاصل از هضم آنزیمی از روی ژل آگارز……………34

2-14- هضم آنزیمی با آنزیم‏های محدود کننده تیپ …………………………………………..II35

2-15- الکتروفورز محصولات واکنش‏های هضم آنزیمی…………………………………………39

2-16- واکنش اتصال………………………………………………………………………….39

2-17- تکثیر پلاسمید………………………………………………………………………….42

2-18- اندازه‏گیری دانسیته نوری(OD) باکتری…………………………………………………..42

2-19- تکنیک Colony-PCR: غربالگری کلونی‏های نوترکیب……………………………………42

2-20- استخراج پلاسمید در مقیاس کم ……………………………………(Mini-Preparation)43

2-21- توالی‏یابی………………………………………………………………………………43

2-22- انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با‏ استفاده از روش ذوب و انجماد…………………………………………………………………43

فصل سوم: نتیجه‏گیری و بحث

3- شناسایی باکتری Xcc (A*)……………………………………………………………………………………………………………………..47

3-1-  شناسایی به کمک تست بیماریزایی بر روی گیاه میزبان C.auratifolia…………………………………47

3-2-  شناسایی به کمک آغازگرهای اختصاصیMS+/MS-  و Xac01 / Xac02……………………………….48

3-3-  استخراج DNA ژنومی از باکتری XCC……………………………………………………………………………49

3-4-  تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده………………………………………………50

3-5- تکثیر ژن‏هایhrpW  و hrpG با واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………….51

3-5-1-  طراحی آغازگرهای مناسب……………………………………………………………51

3-5-2-  بهینه‏سازی شرایط واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………51

3-5-3-  الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………………….53

3-6-  تایید ناقل‏های کلونینگ و بیانی از طریق الگوهای برشی حاصل از هضم توسط آنزیم‏های برشی نوع II…………………………………………………………………………………………………………………………………….54

3-7-  همسانه‏سازی ژن‏هایhrpG  و hrpW در ناقل‏های کلونینگ (PGEM7zf(-) , pUC19)………….55

3-8-  تایید همسانه‏سازی ژن‏های هدف در ناقل‏های کلونینگ (pGEM7zf(-))،( pUC19)………………57

3-8-1-  واکنش کلونی PCR کلون‏های گزینش شده……………………………………………57

3-8-2-  تایید همسانه‏سازی ژن‏هایhrpW/G  در ناقل‏های کلونینگ با روش هضم آنزیمی…………58

3-8-3-  تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل‏های کلونینگ با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………………………………………………………59

3-9- همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121………………………………………………………59

3-10- تایید همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121…………………………………………….62

3-10-1- واکنش کلونی PCR کلون‏های تشکیل شده……………………………………………62

3-10-2- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش هضم آنزیمی.63

3-10-3- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………….64

3-11- توالی‏یابی……………………………………………………………………………..65

3-11-1- نتایج توالی‏یابی……………………………………………………………………..66

3-12- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpG و pBI.hrpW به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس.67

3-13- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس……..67

3-13-1- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G با روش کلونی PCR…………………………..67

فصل چهارم: جمع‏بندی کلی و پیشنهادها

4- جمع‏بندی کلی نتایج……………………………………………………………………….70

4-1- پیشنهادها………………………………………………………………………………71

پیوست

5- دستورالعمل استخراج و خالص‏سازی DNA ژنومی باکتری xanthomonas citri pv. citri سویه 088(A*) NIGEB-……………………………………………………………………………………………………………………………………84

5-1-  محلول‏های لازم جهت استخراج DNA ژنومی……………………………………………84

5-1-1- مراحل استخراج DNA ژنومی…………………………………………………………85

5-1-2- روش اسپکتروفوتومتری………………………………………………………………86

5-1-3- الکتروفورز بر روی ژل آگارز………………………………………………………….87

6- الکتروفورز با ژل آگارز……………………………………………………………………………………. 88

6-1- نمای ساده از دستگاه الكتروفورز…………………………………………………………88

6-2- ژل آگارز……………………………………………………………………………….89

6-3- اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………….89

6-4- بافر بارگزاری ژل آگارز………………………………………………………………….90

6-5- طرز تهیه محلول …………………………………………………………….TBE 0.5X91

6-6- طرز تهیه آگارز 1%……………………………………………………………………………………………..91

7- دستورالعمل خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده و قطعات DNA از روی ژل آگارز…………………92

7-1- خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده با کیت ……………………………………..Bioneer92

7-2- خالص‏سازی قطعات DNA از ژل آگارز……………………………………………………………………………93

8- دستورالعمل تهیه باكتری‏های مستعد برای پذیرش DNA خارجی…………………………………….95

8-1- تهیه سلول‏های مستعد E.coli……………………………………………………………………………95

8-2- دستورالعمل تراریزش باکتری مستعد به روش شوک حرارتی………………………………………………96

8-3- تهیه‏ی سلول‏های مستعد و انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و  pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با استفاده از روش ذوب و انجماد……………………………………………………….97

9- استخراج پلاسمید در مقیاس کم از باکتری E.coli سویه DH5α……………………………………………..99

9-1- استخراج پلاسمید به روش دستی…………………………………………………………99

9-2- استخراج پلاسمید با استفاده از کیت MBST (دکتر شایان)…………………………………….101

9-3- روش تهیه محلول های IPTG و …………………………………………………X-Gal103

9-3-1- تهیه محلول ایزوپروپیل D-B تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)…………………………………………….103

9-3-2- تهیه 5 برمو-3 کلرو- اتیدولیل D-B گالاکتوزید (X-Gal)………………………………103

10- تهیه مایه تلقیح و بهینه‏سازی شرایط مایه‏زنی گیاه میزبان……………………………………………………..103

فهرست جداول

1-1- بیماریزایی فرم‏های مختلف شانکر روی چهار گونه از مرکبات………………………………….       12

1-2- مشخصات آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر و شناسایی………………………………………….     29

2-2- برنامه Multipelex PCR با آغازگر‏های MS+/MS-  و Xac01/Xac02………………………          30

3-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش Multipelex PCR جهت شناسایی باکتری…………….         30

4-2- شیب‏ دمایی به‏کار رفته برای تعیین بهترین دمای اتصال با آنزیم Taq………………………….       32

5-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز……….         32

6-2- چرخه حرارتی به‏کار ‏رفته برای تکثیر نهایی با آنزیم pfu………………………………………….      33

یک مطلب دیگر :

7-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpW و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pGEM7zf(-))…………….          36

8-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pUC19)……………………..        36

9-2- شرایط واکنش دوتایی هضم آنزیمی جهت تایید ناقل‏های همسانه‏سازی ((-)pGEM7zf) و (pUC19)……………………………………………………………………………………………………………..     37

10-2– شرایط واکنش هضم دوتایی آنزیمی جهت تایید ناقل بیانی(pBI121)……………………..        37

11-2- شرایط واکنش هضم آنزیمی ژن hrpW و pBI121 جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل……………………………………………………………………………………………………………………….    38

12-2– شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل بیانی جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل…………………………………………………………………………………………………………………………. 38

13-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpG)…………………………………………………………..         40

14-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpW)……………………………………………………………       40

15-2- شرایط واکنش اتصال (pUC19-hrpG)…………………………………………………………….        41

16-2- شرایط واکنش اتصال (pGEM7zf(-)-hrpW)……………………………………………………         41

17-2- چرخه حرارتی به‏کار رفته برای واکنش کلونی PCR به منظور تایید همسانه‏سازی در وکتور بیانی……………………………………………………………………………………………………………………..   45

18-2- ترکیبات محلول مادری واکنش زنجیره‏ای کلونی PCR جهت تایید عمل همسانه‏سازی دروکتورهای کلونینگ و بیانی……………………………………………………………………………………     45

1-5- مواد و مقدار مورد نیاز جهت تهیه بافر Loading dye………………………………………………     9

فهرست شکل‏ها

1-3- تست بیماریزایی روی لیمو………………………………………………………………………………………………48

2-3- تست (Xaco1 / Xaco2 / MS+/MS) Multiplex PCR……………………………………………………..49

3-3- اکتروفورزDNA ژنومی استخراج شده بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………..50

4-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با Taq دی.ان.آ پلیمراز و گرادیان دمایی جهت بهینه‏سازی بهترین دمای اتصال با پرایمرهای اختصاصی………………………………………………………………………………………………….53

5-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز برای تکثیر ژن‏های hrpG , hrpW با آغازگرهای اختصاصی و آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز………………………………………………………………………………………………………………………..53

6-3- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگ و بیانی با آنزیم‏های برشی نوع II بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………………………………………………………………………………………..54

7-3- هضم آنزیمی فراورده ژن‏هایhrpG  و hrpW جهت بازیابی از روی ژل آگارز)الف) و قطعات بازیابی شده(ب)………………………………………………………………………………………………………………………55

8-3- هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگpUC19  و pGM7zf(-) جهت بازیابی از ژل آگارز(الف) قطعات بازیابی شده(ب)……………………………………………………………………………………………………………………..55

9-3- واکنش کلونی PCR برای کلون‏های سفید حاصل ازhrpG  و hrpW……………………………………58

10-3- هضم آنزیمی پلاسمیدهای استخراج شده از کلونی‏های حاصل از واکنش اتصال pGEM و hrpw و همچنینhrpG  و pUC19……………………………………………………………………………………………………..58

11-3- الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز پلاسمیدهای تایید شده بر روی ژل آگارز 1%….59

12-3- هضم آنزیمی ناقل بیانی جهت بازیابی از روی ژل آگارز (الف) قطعات بازیابی شده (ب)……..61

13-3- فراورده بازیابی شده ناقل بیانی و ژن‏های hrpW/G جهت تعیین نسبت واکنش اتصال…………..62

14-3-  واکنش کلونی PCR تعدادی از کلون‏های حاصل از مخلوط اتصال وکتور pBI121 و ژن‏های hrpG و hrpW……………………………………………………………………………………………………………………….63

15-3- هضم آنزیمی دوتایی پلاسمیدهای نوترکیبpBI.hrpG  و pBI.hrpW با آنزیم‏هایXbaI/BamHI XbaI/SacI……………………………………………………………………………………………………………………………..64

16-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز برای پلاسمیدهای نوترکیبpBI.hrpG  و pBI.hrpW جهت بررسی حضور ژن‏های مذکور……………………………………………………………………………………………………………..65

17-3- پلاسمیدهای نوترکیب استخراج شده……………………………………………………………………………..66

18-3- واکنش کلونی PCR تعدادی از کلون‏های حاصل از انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G  به          سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس…………………………………………………………………………………………. 68

چکیده

بیماری شانکر به‏وسیله‏ی باکتری (Xanthomonas  citri pv. citri) ایجاد می‏شود که هر ساله عملکرد و کیفیت محصولات خانواده مرکبات، به‏ویژه لیمو‏ترش و پرتقال را تحت تاثیر خود کاهش می‏دهد. این پژوهش با هدف جداسازی و همسانه‏سازی دو ژن رمز کننده‏ی هارپین‏های HrpW و HrpG از باکتری Xcc سویه NIGEB-088 و ساخت پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpG و pBI-hrpW به‏منظور توسعه‏ی استراتژی مقاومت به بیماری شانکر بر مبنای القای واکنش دفاعی در گیاه لیموترش انجام شد. بدین منظور آغازگرهای اختصاصی (رفت و برگشت) برای تکثیر این ژن‏ها با استفاده از توالی کامل DNA ژنومی باکتری عامل این بیماری، طراحی شد. ژن‏های تکثیر شده سپس به منظور همسانه‏سازی، در پلاسمید‏های pGEM7zf(-) و همچنین pUC19 به ترتیب برای ژن‏های hrpW و hrpG،  با جایگاه‏های برشی XbaI و SacI و همچنین XbaI وBamHI وارد شد و پلاسمیدهای نوترکیب در باکتری E.coli سویه DH5α تراریخت شدند. به منظور بیان ژن‏ها در گیاه، قطعه‏ی مورد نظر در ناقل pBI121 و در جایگاه‏های برشی برای ژن‏های هدف همسانه‏سازی شد، به‏طوری ‏که ژن‏های مورد نظر تحت کنترل پیشبر ویروس موزائیک گل کلم 35S و پایان‏بر NOS در ناحیه‏ی  DNA T- این ناقل قرار گرفت. با استفاده از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز، هضم آنزیمی و توالی‏یابی حضور ژن‏های هدف در کلونی‏های مثبت مورد تایید قرار گرفت. این ناقل‏های پلاسمیدی نوترکیب را می‏توان در انتقال ژن به گیاهان حساس به این بیماری مانند لیمو ترش و پرتقال با استفاده از آگروباکتریوم مورد استفاده قرار داد. در نهایت پلاسمیدهای نوترکیب به سویه‏های مورد نظر آگروباکتریوم تومفاسینس منتقل و حضور ژن‏های مربوطه مورد تایید واقع شد. سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس تایید شده در برنامه‏های انتقال ژن مورد استفاده قرار خواهند گرفت.