2-4. کشت و تکثیر. …13

2-4-1. شرایط کشت بنفشه آفریقایی.. 13

2-5. بیماری­های مربوط به بنفشه آفریقایی.. 17

2-5-1. بیماری­های ناشی از عوامل غیر زیستی.. 17

2-5-2. بیماری­های ناشی از عوامل زیستی.. 18

2-6. اهمیت بنفشه آفریقایی.. 20

2-7. اصلاح بنفشه آفریقایی.. 21

2-7-1. روش­های اصلاحی.. 21

2-8. اهمیت تنوع ژنتیكی.. 21

2-9. حفاظت منابع ژنتیكی.. 22

2-10. روش‌های ارزیابی تنوع ژنتیكی.. 23

2-10-1. نشانگرهای مورفولوژیكی.. 23

2-10-3. نشانگرهای مولكولی.. 24

2-10-4. نشانگرهای پروتئینی.. 24

2-10-5. نشانگرهای DNA.. 24

2-10-6. نشانگرهای غیرمبتنی بر پی سی آر. 26

2-10-7- نشانگرهای مبتنی بر پی سی آر. 27

2-10-8. DNA پلی مورف تکثیر یافته تصادفی.. 31

2-10-8-1. کاربرد به کارگیری تکنیک RAPD ..32

2-10-8-2. کاربردهای نشانگر RAPD …..32

2-10-8-3. مزایای نشانگرهای RAPD …………..32

2-10-8-4. معایب نشانگرهای RAPD ……….34

2-10-8-5. ویژگی­ها و کاربردهای نشانگرهای مرتبط با RAPD ……….35

2-11. واکنش زنجیره پلی­مراز. 37

2-11-1. اجزای واكنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR) 38

2-11-2. مراحل تكثیر. 40

2-11-3. كاربردهای پی سی آر. 41

2-12. الكتروفورز. 42

2-12-1. الكتروفورز ژل آگارز. 43

2-13. درخت فیلوژنتیک… 45

2-13-1. پیچیدگی ژنوم و بررسی فیلوژنتیک: 45

2-13-2. اندازه‌گیری فواصل و تشابهات ژنتیكی.. 49

2-13-3. روش‌های آماری برای تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیكی.. 50

2-13-4. تجزیه خوشه‌ای.. 50

2-13-5. ضریب همبستگی كوفنتیكی.. 51

2-13-6. تجزیه به مؤلفه­های اصلی.. 51

2-14. مروری بر تحقیقات پیشین.. 52

فصل سوم……..57

روش شناسی تحقیق.. 57

3-1. تهیه نمونه گیاهی.. 57

3-2. استخراج DNA.. 57

3-3. تعیین كیفیت نمونه­های DNA.. 59

3-4. تعیین كمیت نمونه‌های DNA.. 60

3-5. تنظیم غلظت نمونه‌های DNA 60

3-6. انتخاب آغازگرها 60

3-7. انجام واكنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز. 60

3-8. الكتروفورز فراورده‌های PCR.. 62

3-9. تجزیه و تحلیل‌های آماری.. 62

فصل چهارم. 64

تجزیه و تحلیل داده­ها 64

4-1. تعیین كمیت و كیفیت DNA ژنومی.. 64

4-2. واكنش زنجیره‌ی پلیمراز. 65

4-3. تجزیه باندهای ایجاد شده 66

4-3-1. بررسی محتوای اطلاعاتی به دست آمده 67

4-4. تجزیه خوشه‌ای.. 72

فصل پنجم. 74

بحث و نتیجه­گیری.. 74

5-1. استخراج DNA.. 74

یک مطلب دیگر :

5-2. واکنش زنجیره پلی­مراز…….75

5-2-1. بهینه سازی مواد به کار رفته در پی سی آر………..75

5-2-2. بهینه سازی شرایط پی سی آر……………75

5-3. پیشنهادات.. 76

منابع. 78

پیوست… 82

چکیده انگلیسی. 84

بررسی تنوع ژنتیکی بنفشه آفریقایی(Saintpauli ionantha) با استفاده از مارکر مولکولی RAPD

چکیده

تنوع ژنتیكی و ارزیابی ارقام مطرح بنفشه­ی آفریقایی(Saintpauli ionantha) در سطح مولكولی با استفاده از نشانگر RAPD انجام شد. به منظور استخراج DNAاز روش تغییر یافته Doyle and Doyle استفاده شد و در گام بعد 6 ژنوتیپ با 15 آغازگر مورد بررسی قرار گرفتند. از 15 آغازگر مورد بررسی روی DNA ژنومی 311 باند تولید شد که 290 باند پلی مورفیسم داشتند. آغازگر I، کمترین باند و آغازگر G بیشترین باند را تولید کرد. اندازه­ی قطعات DNA تولید شده بین 200 بیس باز تا 4000 بیس باز بود. میانگین قدرت تفكیك نیز 79/0 بود. باندهای تولید شده برای آنالیزهای استاتیک مورد استفاده قرار گرفتند. برای رسم درخت فیلوژنیک از نرم افزار UPGMA استفاده شد. تشابه ژنتیکی بین 57/0 تا 72/0 است. و ضریب جاکارد بین دندروگرام و ماتریس تشابه 78/0 به دست آمد که نشان دهنده برازش مناسب دندروگرام به ماتریس تشابه بوده است. نتایج به دست آمده نشان می­دهد که نشانگر مولکولی RAPD ابزاری سودمند برای بررسی پراکندگی ژنتیکی و ارتباطات خانوادگی بین واریته­های بنفشه­ی آفریقایی است.

کلمات کلیدی: بنفشه­ی آفریقایی، مارکر مولکولی، تنوع ژنتیکی، آنالیزهای استاتیک، درخت فیلوژنی

کلیات تحقیق

جمعیت جهان در قرن 21 از مرز 6 میلیارد نفر كنونی گذشته و به بیش از 10 میلیارد نفر خواهد رسید. یكی از معایب این افزایش جمعیت استفاده بی­رویه از منابع طبیعی در جهت افزایش تولیدات كشاورزی می‌باشد. در بسیاری از این موارد، این افزایش تولید با تخریب منابع زیستی و فرسایش شدید ذخایر توارثی همراه بوده است. حفاظت و استفاده از منابع ژنتیكی گیاهی برای بقاء و بهبود تولیدات زراعی ضروری می‌باشد و به عنوان نیاز اساسی در توسعه پایدار، خلق واریته­های جدید، و كاهش فقر محسوب می‌شود.

تنوع، مبنای همه گزینش­ها است و انتخاب ژنوتیپی نیز نیازمند تنوع است. با بالا رفتن تنوع ژنتیكی در یك جامعه، حدود انتخاب هم در طبیعت و هم به­طور مصنوعی وسیع می‌شود. با توجه به رابطه مثبت بین میزان تنوع ژنتیكی و مقدار وقوع تغییرات تكاملی در آن، رابطه مشابه­ی نیز بین كارایی بهبود ژنتیكی اصلاح یك جامعه و تنوع ژنتیكی برای صفت مورد علاقه موجود است. تمایل به حذف تنوع ژنتیكی در توده­های بومی اولیه، واریته­های سازگار به نیازهای غیر قابل پیش بینی آینده را به خطر می­اندازد.

بنابراین حفظ و نگهداری ذخایر توارثی ضروری می‌باشد. به­طور كلی یكی از اولین قدم­ها در یك برنامه به نژادی موفق، تشخیص صحیح ژنوتیپ‌های مطلوب است، كه برای صحیح عمل نمودن دراین راستا به نكات خاصی باید توجه نمود. اثرات متقابل ژنوتیپ و محیط، اتخاذ روش صحیح گزینش، و استفاده از نشانگرهای مولكولی مناسب برای تشخیص ژنوتیپ­ها تو صیه می‌گردد (صالحی، 1378).

برای بررسی تنوع ژنتیكی، نشانگرهای مختلفی وجود دارد که شامل نشانگرهای فیزیولوژیكی، بیوشیمیایی، و مولكولی می­باشد.از معایب نشانگرهای فیزیولوژیكی این است كه در بیشتر موارد تحت تأثیر محیط قرار دارند و گاهی برای مشاهده و ثبت آن­ها باید منتظر ظهور آن­ها ماند كه در مورد گیاهان چند ساله بسیار مشكل می‌نماید. علاوه براین تعداد نشانگرهای مورفولوژیكی كم می‌باشد.

نشانگرهای پروتئینی نیز معایب مخصوص خود را دارا می‌باشند؛ با توجه به این­كه روش­های رنگ آمیزی پروتئین­ها در مورد آیزوزایم­ها چندان زیاد نیست، تعداد آیزوزایم­ها قابل ثبت و مشاهده كه می­توان از آن­ها به عنوان نشانگر استفاده نمود، به صد نمی‌رسد كه این محدودیت از عمده ترین معایب آن­ها است و موجب كاهش كارایی آن­ها می‌گردد. از نكات منفی دیگر این نشانگرها، محدودیت تنوع ژنتیكی قابل ثبت در آیزوزایم­ ها است. به عبارت دیگر آیزوزایم­ها نه تنها كم هستند، بلكه چند شكلی و تفاوت قابل ثبت نیز در آن­ها چندان زیاد نیست. لذا با توجه به معایب نشانگرهای مورفولوژیكی و پروتئینی بهتر است از نشانگرهای مولكولی استفاده كرد، زیرا در آن­ها دقت بالا بوده و كمتر تحت تأثیر شرایط محیطی و غیره قرار می­گیرند (قره­یاضی، 1377).

روش­های مختلف انگشت نگاری دی ان ای^[1] اغلب به دلایل ذیل با هم تفاوت دارند:

1- پیچیدگی روش­های مورد استفاده

2- مقادیر دی ان ای ژنومی

3- نیاز به اطلاع از توالی ژنومی

4- قدرت تحلیل و تعیین وابستگی ژنومی

5- مقدار هزینه

6- وسعت كاربرد

در این بین نشانگر رپید^[2] در بررسی تنوع ژنتیكی بین ارقام زراعی، طبقه بندی آن­ها و نیز تهیه نقشه‌های پیوستگی و آنالیز ژرم پلاسم كاربرد وسیعی پیدا كرده است (اهم و مکنزی، 1992)[3].

نشانگرهای رپید به وسیله تكثیر تصادفی قطعات دی ان ای^[4] ژنومی با آغازگرهای منفرد 10 نوكلئوتیدی همراه با توالی‌های اختیاری به­دست می‌آیند و مزایای فراوانی نسبت به سایر نشانگرها دارند از جمله می­توان به میزان هزینه و كار كمتر، نیاز كمتر به تكنولوژی پیشرفته، نامحدود بودن تعداد، امكان بررسی همزمان چندین لوكوس در ژنوم نمونه‌ها، تجزیه و تحلیل سریع و آسان تعداد زیادی از نمونه­ها، و عدم استفاده از مواد خطرناك رادیواكتیو اشاره كرد (كیانی و همكاران، 1381).

از كاربردهای رپید می‌توان به موارد ذیل اشاره کرد(كیانی و همكاران، 1381):