فصل اول: مقدمه	1
1-1-مقدمه	2
1-2-انجماد	2
1-2-1-تاریخچه ی انجماد	3
1-2-2-تکنیک های مختلف انجمادی	3
1-2-2-1-انجماد آهسته	4
1-2-2-2-انجماد شیشه ای	5
1-2-3-محلول های انجمادی	5
1-2-3-1-ضدیخ ها	5
1-2-3-2-سرم	7
1-2-4-تاثیرات انجماد بر بافت بیضه	7
3- 1-3-پیوند	9
4- 1-4-کشت	10
5- 1-5-تغییرات ملکولی متاثر از انجماد	11
1-5-1-آپوپتوزیس	12
1-5-1-1-مسیر خارجی آپوپتوز و ژن های دخیل در آن	13
1-5-1-2-مسیرداخلی آپوپتوز و ژنهای دخیل در آن	14
1-5-1-3-P53	16
1-5-1-4-کاسپاز 3	17
1-6-هدف	18
1-7-پرسش پژوهشی	18
1-8-فرضیات	18
فصل دوم : مواد و روش ها	19
2-1-تهیه ی بافت بیضه و گروه های مورد مطالعه	20
2-2-انجماد شیشه ای بافت بیضه	21
2-2-1-روش تهیه محیط پایه	21
2-2-2-روش تهیه محلول های انجماد شیشه ای	21
2-2-2-1-روش آماده سازی محلول انجمادی I	21
2-2-2-2-روش آماده سازی محلول انجمادی II	22
2-2-3-مراحل انجماد شیشه ای	22
2-2-3-1-روش انجمادی I	22
2-2-3-2-روش انجمادی II	23
2-2-4-ذوب بافت بیضه	23
2-2-4-1-روش تهیه محلول های ذوب	23
2-2-4-2-مراحل ذوب	23
2-5-مطالعات میکروسکوپی و بافت شناسی بافت بیضه	24
2-6-بررسی آپوپتوز و بقا سلولی	26
2-6-1-هضم مکانیکی و آنزیمی بافت بیضه	26
2-6-1-1-هضم مکانیکی	27
2-6-1-2-هضم آنزیمی	27
2-6-1-3-خنثی سازی اثر آنزیم و بررسی بقا با استفاده از رنگ PI	27
2-6-2-ارزیابی بقای سلولی به روش فلوسایتومتری	28
2-6-3-بررسی آپوپتوز سلولی	29
2 -7-کشت بافت بیضه	30
2-7-1-آماده سازی آگار	30
2-7-2-آماده سازی محیط کشت	31
2-7-2-1-روش تهیه محیط RPMI	31
2-7-3-کشت بافت بیضه	32
2-8-ارزیابی ژن های آپوپتوزی	32
2-8-1-نگهداری بافت در محلول RNA-later	32
2-8-2-استخراج RNA با استفاده از ترایزول	32
2-8-2-1-هموژن کردن بافت  2-8-2-2-مرحله ی جداسازی	33  33
2-8-2-3-رسوب RNA	33
2-8-2-4-شستشو RNA	33
2-8-3-بررسی کیفی RNA های استخراج شده	34
2-8-4-تیمار نمونه­یRNA  با استفاده از DNase1 جهت حذف آلودگی ژنومی	34
2-8-5-سنتز cDNA	35
2-8-6-پرایمر	37
2-8-6-1-آماده سازی پرایمرها	37
2-8-6-2-بررسی جایگاه اتصال پرایمرها	39
2-8-7-الکتروفورز	39
2-8-7-1-روش ساخت بافر50X TAE	39
2-8-7-2-روش ساخت بافر X TAE1	40
2-8-7-3-طرز تهیه ی ژل آگارز	40
2-8-7-4-بررسی آلودگی پرایمر	40
-8-7-4-بررسی کیفیت RNA	41
2-8-8-بررسی گرادیانت دمایی پرایمر	41
2-8-9 Real-Time PCR	42
2-8-9-2-بررسی کمی بیان ژن با استفاده از روش Real-Time PCR	43
2-9-آنالیز آماری داده	44
فصل سوم: نتایج	45
3-1-بررسی مورفولوژی بافت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	46
3-2-مقایسه بقای سلولی در گروه کنترل با گروه های انجمادی I و II بلافاصله پس از ذوب	46
3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه	47
3-3-1-ارزیابی میزان بقای سلولی طی کشت بافت بیضه	47
3-3-2-آپوپتوز اولیه ی سلولی طی کشت بافت بیضه	47
3-3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه	48
3-3-4-نکروز بافتی طی کشت بافت بیضه	48
3-4-بررسی بیان ژن های آپوپتوزی در سطح رونوشت	49
3-4-1-بررسی بیان رونوشت ژن های دخیل در مسیر های آپوپتوزی	49
3-4-2-Bax	49
3-4-3-BCL2	49
3-4-4-نسبت بیان BAX به BCL2	50
3-4-5-Caspase3	50
3-4-6-Fas	50
3-4-7-Fas Ligand	51
3-4-8-P53	51
27- فصل چهارم: بحث	66
4-1-کلیات	67
4-2-بررسی های مورفولوژیک در ساعات مختلف کشت در گروه های مورد مطالعه	68
4-3-بررسی بقا و آپوپتوز سلولی در گروه های مورد مطالعه	69
4-4-بررسی بیان ژن های مرتبط با وقوع آپوپتوز در گروه های مورد مطالعه	71
4-5-نتیجه گیری	75
4-6-پیشنهادات	76

 

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                    صفحه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

یک مطلب دیگر :

دانلود پایان نامه حقوق با موضوع سازمان بهداشت جهانی

 

جدول 2-1-مراحل رنگ آمیزی  هماتوکسیلین ایوزین	26
جدول2-2-مشخصات پرایمرهای مورد استفاده	39
جدول 2-3-برنامه ی مورد استفاده جهت بررسی گرادیانت دمایی پرایمرها	42
جدول 3-1- میانگین بقای سلولی درگروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II	53
جدول3-2- میانگین بقای سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف	53
جدول 3-3- میانگین درصد آپوپتوز اولیه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-4-میانگین درصد آپوپتوز ثانویه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II  در ساعت های مختلف کشت	54
جدول 3-5- میانگین درصد سلول های نکروتیک در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II  در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-6-میزان بیان ژن Bax در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	55
جدول 3-7-میزان بیان ژن BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت53	56
جدول3-8-نسبت بیان  BAX به BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	56
جدول3-9-میزان بیان ژن Caspase3 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-10-میزان بیان ژن Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	57
جدول 3-11-میزان بیان ژنLigand   Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58
جدول 3-12- میزان بیان ژن P53 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت	58

 

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1-1-مسیرهای شرکت کننده در رخداد آپوپتوز	16
شکل2-1-ارزیابی بقای سلولی با روش فلوسایتومتری	28
شکل2-3-ارزیابی وقوع آپوپتوز	30
شکل3-1-داده های حاصل از آنالیز بقای سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II در زمان صفر	59
شکل3-2-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت صفر	60
شکل3-3-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت 3 پس از کشت	61
شکل3-4-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت 20 پس از کشت	62
شکل 3-5-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی در زمان صفر بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	63
شکل 3-6-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی 3 ساعت پس ازکشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین	64
شکل 3-7- بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی 20 ساعت پس از کشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین