کلونینگ و بیان بخش‌های آنتی ژنیک سیتوتوکسین مرتبط با ژن A ...

2-2-3 کاربرد‌های بیوآنالایتیک… 9

2-2-4 استفاده در مواد غذائی.. 10

2-3 هلیکو باکتر پیلوری.. 11

2-3-1 علائم و نشانه‌ها 11

2-3-2 میکروبیولوژی.. 12

2-3-3 ژنوم. 13

2-3-4 زیرواحد CagA هلیکوباکتر پیلوری.. 14

2-3-5 نقش CagA در سرطان. 15

2-3-6 پاتوفیزیولوژی.. 15

2-3-7 التهاب، ورم معده و زخم. 16

2-3-8 جزیره بیماریزائی Cag.. 17

2-3-9 سرطان. 18

2-3-10 آسیب شناسی.. 19

2-3-11 پیشگیری.. 19

2-3-12 درمان. 20

2-3-13 پیش بینی بیماری.. 21

2-3-14 بقاء هلیکوباکتر پیلوری.. 22

2-3-15 همه گیر شناسی باکتری (Epidemiology). 24

2-4 آنتی ژن‌ها 25

2-4-1 ساختمان آنتی ژن. 25

2-5 اپی توپ‌ها 26

2-5-1 انواع اپی توپ‌ها 26

2-5-2 عملکرد. 27

2-5-2-1 اپی توپ‌های سلول T.. 27

2-5-3 واکنش متقاطع.. 28

2-5-4 نقشه برداری اپی توپ فضائی.. 28

2-5-5 نشانه‌های اپی توپ… 28

2-6 تحقیقات انجام شده در این زمینه. 29

2-7 ابزار‌های مورد استفاده 38

2-7-1 دات بلاتینگ… 38

2-7- 2 نرم افزار CLC Work Bench5. 38

2-7-3 نرم افزار Mega5. 39

2-7-4 ابزار BLAST.. 39

3 مواد و روش‌ها 40

3-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 40

3-2 تهیه باکتری هلیکو باکتر پیلوری.. 41

3-3 استخراج DNA و تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 41

3-3-1 تعیین کمیت و کیفیت DNA با ژل آگارز. 41

3-4 تعیین غلظت DNA استخراج شده 42

3-5 طراحی آغازگرها 42

3-6 انجام واکنش PCR.. 43

3-7 خالص سازی محصول PCR.. 44

3-7-1 بررسی بر روی ژل الکتروفورز. 45

3-8 طرز تهیه محلولهای مورد استفاده در کلونینگ… 45

3-8-2 محلول غلیظ آنتی بیوتیک آمپیسیلین.. 46

3-8-3 محلول غلیظ IPTG (0. 1M). 46

3-8-4 محلول غلیظ X-Gal (20mg/ml). 46

3-8-5 محیط کشت LB مایع.. 46

3-8-6 محیط کشت LB-Agar جامد. 47

3-9-2 هضم pET-32a (+). 49

3-9-3 خالص سازی pET-32a (+) و قطعه هدف… 49

3-9-4 نانودراپ محصولات خالص شده 50

3-9-5 انجام واکنش الحاق قطعه هدف ژن CagA با pET-32a (+). 50

3-9-6 جوان سازی باکتری DH5α.. 51

3-9-7 تهیه سلول‌های مستعد DH5α.. 52

3-9-8 انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری.. 52

3-9-9 کشت پرگنه‌‌ها و غربال گری باکتری های نوترکیب… 53

3-9-10 کلونی PCR.. 53

3-9-11 استخراج پلاسمید نوترکیب… 54

3-9 -12 تایید کلونیها از طریق هضم آنزیمی.. 55

3-10 توالی یابی.. 56

3-11 انتقال پلاسمید pET-32a (+) حاوی ژن هدف به باکتری BL21 (DE3). 56

3-12 تحریک بیان ژن هدف… 56

3-13 استخراج پروتئین از باکتری.. 57

3-14 الکتروفورز پروتئینها به روش SDS-PAGE. 58

3-14-1 مراحل بستن ژل به صورت زیر انجام شد: 59

3-15 دات بلات… 61

3-16 محلولها و بافرها 62

3-16-1 بافر شستشو یا محلول TBS. 62

3-16-2 محلول بلوکه کننده 62

3-16-3 بافر شستشو یا محلول TBS-T.. 62

3-16-4 آنتیبادی اولیه. 62

3-16-5 آنتیبادی ثانویه. 62

3-16-6 روش تهیه محلول رنگ آمیزی DAB.. 62

3-17 خالص سازی پروتئین.. 64

3-18 آماده سازی آنتی ژن ایمنی زا برای تزریق به مرغ. 64

3-19 ایمنی زائی مرغ‌ها جهت تولید آنتی بادی اختصاصی.. 65

3-19-1 تزریق اولیه: 65

3-19-2 تزریق‌های ثانویه (Booster injection). 66

3-20 جمع آوری و ذخیره تخم مرغ. 66

3-21 جداسازی IgY با استفاده از روش پلی اتیلن گلایکول 14700.. 66

3-22 بررسی IgY به روش الکتروفورز SDS-PAGE و دات بلات… 67

4 نتایج و بحث… 67

4-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 67

4-2 تایید آلودگی نمونه‌های بیوپسی.. 69

4-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA.. 69

4-4 بررسی محصولات PCR.. 70

4-5 خالص سازی محصول PCR.. 71

4-6 هضم PET32a (+) و ژن CagA.. 71

4-7 کلونینگ ژن CagA در باکتری DH5α.. 72

4-8 تأیید صحت قطعه کلونشده در pET32a (+). 73

4-9 نتایج کلونی PCR.. 73

4-10 تایید نتایج کلونی PCR با استفاده از T7. 74

4-11 استخراج پلاسمید و انجام هضم آنزیمی.. 75

4-12 توالی یابی.. 76

4-13 آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسیدی CagA.. 76

4-14 بیان ژن. 78

4-15 SDS-PAGE. 78

4-16 دات بلات… 79

4-18 تولید IgY ضد هلیکو باکتر پیلوری-CagA در زرده تخم مرغ. 81

5 نتیجه گیری و پیشنهادات… 85

فهرست شکل‌ها

عنوان صفحه

شکل 4-1. نتایج نرم افزار bcepred. 68

شکل 4-2. تست اوره آز انجام شده بر روی نمونه‌های بیوپسی. 69

شکل 4-3. تعیین کیفیت و کمیت DNA. 70

شکل4-5. خالص سازی محصول PCR . 71

شکل4-6. هضم ناقل بیان و قطعه هدف… 72

شکل4-7. کشت خطی از تک کلون‌های رشد کرده بر روی محیط کشت LB-آگار حاوی آمپی سیلین.. 73

شکل 4-8. کلونی PCR. 74

شکل4-9. کلونی PCR با استفاده از پرایمر T7 و T-terminatoor. 75

شکل 4-10. استخراج پلاسمید نوترکیب و هضم آنزیمی.. 76

شکل 4-12. بررسی بیان پروتئین نوترکیب با الکتروفورزSDS-PAGE 78

شکل 4-13. دات بلات پروتئینهای استخراج شده. 79

شکل 4-14.تعیین غلظت پروتئین با استفاده از روش برادفورد. 81

شکل 4-15.خالص سازی پروتئین و حذف باند‌های غیر اختصاصی. 81

شکل 4-16. الکتروفورز SDS-PAGE به منظور بررسی پروتئین زنجیره سبک و سنگین IgY استخراج شده از زرده تخم مرغ 82

فهرست جدول‌ها

عنوان صفحه

جدول 3-1 مواد و مقادیر لازم برای انجام PCR یک واکنش…. 43

جدول3-2. برنامه حرارتی مورد استفاده جهت تکثیر نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 44

جدول3-3 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت LB مایع.. 46

جدول3-4 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت جامد LB-Agar. 47

جدول 3-5 مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم قطعه هدف ژنCagA.. 48

جدول 3-6. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم pET-32a (+) 49

جدول3-7. مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش الحاق.. 50

جدول 3-8. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم پلاسمید pET32a (+)-CagA.. 55

جدول3-9. مواد مورد نیاز برای تهیه بافر Laemmli buffer samples 5X. 58

جدول3-10 مواد و مقادیر لازم جهت تهیه ژل پایینی SDS-PAGE. 58

جدول 3-11 مواد لازم جهت بستن ژل بالایی SDS-PAGE. 59

جدول3-12. مواد و مقادیر مورد نیاز برای بافر 5X تانک SDS-PAGE. 59

فهرست علائم و اختصارات

یک مطلب دیگر :

پایان نامه سنجش کیفیت زندگی:

معادل فارسی	معادل لاتین	علامت اختصاری

آدنوزین دی فسفات	Adenosine 5’-Diphosphate	ADP
آدنوزین تری فسفات	Adenosine 5’-Triphosphate	ATP
جفت باز	Base pair	bp
سرم البومین گاوی	Bovain serum albumin	BSA
دی آمینو بنزیدین	Diamino Benzidine	DAB
آب دوبار تقطیر	Double Distilled Water	ddW
اسید دزوکسی ریبو نوکلئیک	Deoxyribonocleic Acid	DNA
اتیلن دیامین تترا- استیک اسید	Ethylenediaminetetra-acetic acid	EDTA
سازمان امنیت محصولات غذایی	Generally Regarded As Safe	GRAS
ایمنو گلوبین Y	Immunoglobulin Y	IgY
ایمنوگلوبین E	Immunoglobulin E	IgE
ایمنوگلوبین G	Immunoglobulin G	IgG
میواینوزیتول هگزاکیس فسفات	myo-Inositol Hexakisphosphate	Ins P₆
اینوزیتول پلی فسفاتها	Inositol Poly Phosphates	IPPs
تیوگالاکتوپیرانوزید ایزوپروپیل	Isopropyl β -D-thiogalactopyranoside	IPTG
اتحادیه بین الملل شیمی خالص و کاربردی- اتحادیه بین المللی بیوشیمی	International Union of Pure and Applide Chemistry- International Union of Biochemistry	IUPAC- IUB
کیلوباز	Kilobase (pair)	kb
کیلودالتون	kiloDalton	kDa
لوریا- برتانی	Lauria – Bertani	LB
بانک جهانی اطلاعات بیوتکنولوژی	National Center of Biotechnology Information	NCBI
چگالی نوری	Optic Density	OD
چارچوب خواندن آزاد	Open Reading Frame	ORF
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز	Polymerase Chain Reaction	PCR
پروتئین تیروزین فسفات	Protein Tyrosine Phosphatase	PTP
پلی اتیلن گلایکول	Polyethylene glycol	PEG3
جایگاه اتصال ریبوزوم	Ribosomal Binding Site	RBS
دور در دقیقه	Round per minute	rpm
سدیم دودسیل سولفات – ژل الکتروفورز پلیاکریل آمید	Sodium Dodecyl Sulfate –

موضوعات: بدون موضوع لینک ثابت

فرم در حال بارگذاری ...

فید نظر برای این مطلب