1-2 تکنیکهای کمک باروری13
1-2-1 لقاح آزمایشگاهی.. 13
1-2-1-1 کیفیت سلول تخم. 14
1-2-2 کشت آزمایشگاهی رویان. 15
1-2-3 انجماد. 16
1-2-3-1 اصول انجماد. 17
1-2-3-2 مواد سرما محافظ.. 18
1-2-3-3 روشهای انجماد. 19
1-2-3-3-1 انجماد آهسته. 20
1-2-3-3-2 انجماد شیشهای.. 21
1-2-4 سوراخ کردن مصنوعی.. 22
2 مواد و روشها…………………..25
2-1 حیوان.25
2-2 تولید رویان آزمایشگاهی26
2-2-1 استحصال اسپرم. 26
2-2-1-1 آمادهسازی محیط و قطرهها 26
2-2-1-2 جابجایی مهرهی گردنی.. 27
2-2-1-3 تشریح موش نر و جداسازی اپیدیدیم. 28
2-2-1-4 جمعآوری و ظرفیتپذیری اسپرم. 29
2-2-2 استحصال تخمک… 31
2-2-2-1 تحریک تخمکگذاری.. 31
2-2-2-1-1 تزریق داخل صفاقی.. 31
2-2-2-2 آمادهسازی محیط و قطرهها 32
2-2-2-3 جابجایی مهرهی گردنی.. 32
2-2-2-4 تشریح موش ماده و جداسازی لولهی تخمبر. 32
2-2-2-5 جداسازی تودهی تخمک-کومولوس… 33
2-2-3 لقاح آزمایشگاهی.. 34
2-2-3-1 آمادهسازی محیط و قطرهها 34
2-2-3-2 لقاح.. 35
2-2-4 کشت آزمایشگاهی.. 35
2-2-4-1 آمادهسازی محیط و قطرهها 35
2-2-4-2 کشت رویان. 36
2-3 تولید رویان درونتنی37
2-3-1 تحریک تخمکگذاری و جفت اندازی موشها 37
2-3-2 آمادهسازی محیط و قطرهها 37
2-3-3 جابجایی مهرهی گردنی.. 37
2-3-4 تشریح موش ماده و جداسازی لولههای رحمی.. 37
2-3-5 استحصال بلاستوسیست… 38
2-4 سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست39
2-4-1 آمادهسازی محیط و قطرهها 39
2-4-2 آمادهسازی و تنظیم دستگاه ریزدستکاری.. 40
2-4-3 روش کار. 40
2-5 انجماد رویان41
2-5-1 انجماد شیشهای.. 41
2-5-1-1 آمادهسازی محیط و قطرهها 41
2-5-1-2 روش کار. 42
2-5-2 یخگشایی.. 43
2-5-2-1 آمادهسازی محیط و قطرات… 43
2-5-2-2 روش کار. 44
2-6 بررسی بیان ژن.45
2-6-1 استخراج RNA از بلاستوسیست… 45
2-6-2 ساخت cDNA.. 46
2-6-3 طراحی پرایمر. 47
2-6-4 رقیقسازی پرایمرها 47
2-6-5 واکنش زنجیرهای پلیمراز. 48
2-6-6 ژل الکتروفورز محصولات PCR.. 49
2-6-7 واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 49
2-7 طراحی آزمایش52
2-7-1 کاهش مایع بلاستوسل رویانهای درونتنی موش، قبل از انجماد شیشهای52
2-7-2 کاهش مایع بلاستوسل رویانهای برونتنی موش، قبل از انجماد شیشهای..52
2-7-3 آنالیز آماری.. 52
3 نتایج.54
3-1 کاهش مایع بلاستوسل رویانهای درونتنی موش قبل از انجماد شیشهای……………54
3-1-1 نرخ زندهمانی و خروج از زونا 54
یک مطلب دیگر :
3-1-2 بیان نسبی ژنهای Gata6 و Grb2. 56
3-1-2-1 واکنش زنجیرهای پلیمراز. 56
3-1-2-2 واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 57
3-2 کاهش مایع بلاستوسل رویانهای برونتنی موش قبل از انجماد شیشهای.62
3-2-1 نرخ زندهمانی و خروج از زونا 62
3-2-2 بیان نسبی ژنهای Gata6 و Grb2. 64
4 بحث و نتیجهگیری67
5 فهرست منابع..76
6 پیوستها83
فهرست جداول
جدول 1‑1: ترکیبات محیط HTF. 14
جدول 1‑2: ترکیبات محیط KSOM.. 16
جدول 2‑1: محلولهای مورد نیاز برای انجماد شیشهای بلاستوسیست موش.. 42
جدول 2‑2: محلولهای مورد نیاز برای یخگشایی بلاستوسیست موش.. 44
جدول 2‑3: مواد مورد استفاده جهت ساخت cDNA. 46
جدول 2‑4: چرخههای حرارتی ساخت cDNA. 46
جدول 2‑5: مشخصات پرایمرهای طراحی شده 47
جدول 2‑6: مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز 48
جدول 2‑7: چرخههای حرارتی مراحلPCR 48
جدول 2‑8: مواد مورد نیاز جهت انجام Real Time PCR. 50
جدول 2‑9: چرخههای حرارتی Real Time PCR. 50
جدول 3‑1: میزان زندهمانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست درونتنی موش.. 55
جدول 3‑2: میزان زندهمانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست برونتنی موش. 63
فهرست اشکال
شکل 1‑1: مراحل مختلف تکوین پیش از لانهگزینی در موش.. 2
شکل 1‑2: بخشهای مختلف لولهی تخمبر. 3
شکل 1‑3: فرایند گامتزایی. 4
شکل 1‑4: اسپرم و تخمک پستانداران. 5
شکل 1‑5: قطبیت رویان موش. 6
شکل 1‑6: تقسیم مرحلهی 8 به 16 سلولی. 7
شکل 1‑7: تشکیل حفرهی بلاستوسل. 7
شکل 1‑8: آرایش سیستمهای انتقالی در سلولهای تروفواکتودرم 8
شکل 1‑9: بلاستوسیست در حال خروج از زونا 9
شکل 1‑10: مسیر تمایز رده تروفواکتودرم در موش. 10
شکل 1‑11: جدایی دو رده سلولی اندودرم اولیه و اپیبلاست در سه مرحله 11
شکل 1‑12: دخالت مسیر پیامرسان FGF/MAPK 13
شکل 1‑13: فرایند شیشهای شدن محیط انجماد. 21
شکل 1‑14: روشهای مختلف سوراخ کردن مصنوعی حفرهی بلاستوسل. 24
شکل 2‑1: قفسهای دارای سیستم تهویهی مجزا 26
شکل 2‑2: پتری دیش استحصال اسپرم 27
شکل 2‑3: جابجایی مهرههای گردنی. 28
شکل 2‑4: تشریح موش نر 29
شکل 2‑5: جمعآوری اسپرم 30
شکل 2‑6: نحوهی جمعآوری اسپرمهای زنده از حاشیهی قطرهی محیط کشت.. 30
شکل 2‑7: نحوهی ترزیق داخل صفاقی موش.. 31
شکل 2‑8: پتری دیش استحصال تخمک.. 32
شکل 2‑9: جداسازی لولهی تخمبر. 33
شکل 2‑10: جداسازی تودهی تخمک-کومولوس.. 34
شکل 2‑11: پتری دیش IVF. 34
شکل 2‑12: تخمک-کومولوسهای مجزا 35
شکل 2‑13: نحوهی قطرهگذاری محیط KSOM در پلیت کشت رویان. 36
شکل 2‑14: جداسازی لولههای رحمی. 38
شکل 2‑15: استحصال بلاستوسیست از لولهی رحمی. 39
شکل 2‑16: پتری دیش ریز دستکاری. 40
شکل 2‑17: نحوهی سوراخ کردن حفرهی بلاستوسیست.. 41
شکل 2‑18: نحوهی قطرهگذاری محلولهای انجماد شیشهای. 42
شکل 2‑19: موقعیت قرار گیری بلاستوسیست بر روی کرایوتاپ 43
شکل 2‑20: پتری دیش حاوی محلول یخگشایی. 44
شکل 3‑1: بلاستوسیستهای درونتنی موش بعد از انجماد-ذوب در محیط KSOM.. 56
