1-6- 2- انتقال عمودی…………………………………………………………………………………………………… 18

2-6- 2-انتقال افقی…………………………………………………………………………………………………………. 19

3-6- 2- انتقال از راه شیر………………………………………………………………………………………………. 20

4-6- 2- انتقال از راه جفتگیری…………………………………………………………………………………….. 20

7- 2- نشانه های بالینی……………………………………………………………………………………………………….. 21

1- 7- 2- گاو ………………………………………………………………………………………………………………….. 21

2- 7- 2- گوسفند…………………………………………………………………………………………………………… 22

3- 7- 2- اسب………………………………………………………………………………………………………………… 23

4-7- 2- بز……………………………………………………………………………………………………………………….. 23

عنوان                                                                                                                      صفحه

5-7- 2- سگ………………………………………………………………………………………………………………….. 23

6- 7- 2- گربه…………………………………………………………………………………………………………………. 24

7- 7- 2- انسان……………………………………………………………………………………………………………….. 24

8- 2- بیماریزایی………………………………………………………………………………………………………….. 25

1- 8- 2- مکانیسم سقط جنین ……………………………………………………………………………………. 26

2-8- 2-  آسیب های وارده به جفت  ………………………………………………………………………….. 27

3- 8- 2- آسیب های وارده به جنین……………………………………………………………………………. 27

9-2 – یافته‌های كالبدگشایی………………………………………………………………………………………………… 31

10-2-خسارات اقتصادی نئوسپوروزیس در گاو………………………………………………………………….. 31

11-2- عوامل مستعد كننده………………………………………………………………………………………………… 33

1-11-2-  حضور سگ ها……………………………………………………………………………………………….. 33

2-11-2-  سایر گوشتخواران………………………………………………………………………………………….. 33

3-11-2-  میزبان‌های واسط به غیر از گاو……………………………………………………………………. 33

4- 11-2- چراگاه، علوفه و آب شرب……………………………………………………………………………. 34

5-11-2- سن گله…………………………………………………………………………………………………………… 34

6-11-2- خوردن شیر یا آغوز………………………………………………………………………………………… 34

7- 11-2- سرکوب ایمنی ……………………………………………………………………………………………… 34

8- 11-2- تراكم گله و ابعاد مزرعه……………………………………………………………………………….. 35

9-11-2- آب و هوا…………………………………………………………………………………………………………. 35

10- 11-2- تراكم جمعیت انسانی………………………………………………………………………………… 35

11-11-2- فصل و نژاد……………………………………………………………………………………………………. 35

12-11-2- پرورش………………………………………………………………………………………………………….. 35

12-2- ایمنی…………………………………………………………………………………………………………………………. 36

13-2- تشخیص…………………………………………………………………………………………………………………….. 37

1- 13-2- روش‌های سرولوژیك…………………………………………………………………………………….. 38

1- 1- 13-2- روش ایمونو فلورسنت آنتی بادی غیر مستقیم   (IFAT)……………. 40

2- 1- 13-2- روش آگلوتیناسیون مستقیم  (DAT) …………………………………………… 41

3- 1- 13-2- روش الایزا ……………………………………………………………………………………….. 42

4-1- 13-2- تست لاتکس آگلوتیناسیون (LAT)…………………………………………………. 42

2- 13-2 – روش های تشخیص بافتی………………………………………………………………………….. 46

عنوان                                                                                                                      صفحه

1-2-13-2 –  هیستوپاتولوژی…………………………………………………………………………………… 46

2-2-13-2 –  هیستوشیمی……………………………………………………………………………………… 47

3-2- 13-2 – ایمنوهیستوشیمی……………………………………………………………………………. 47

3-13-2 –  تكنیك‌های مولكولی………………………………………………………………………………. 48

4- 13-2 – استفاده از  مدل های حیوانی……………………………………………………………….. 48

5-13-2 –  روش كشت سلول………………………………………………………………………………….. 49

6-13-2 – تشخیص تفریقی………………………………………………………………………………………. 50

14-2 – درمان……………………………………………………………………………………………………………………….. 50

15-2 – پیشگیری و کنترل………………………………………………………………………………. 51

16-2 – پروتئین های نوترکیب و اهمیت آنها………………………………………………………………………. 52

1-16-2 – سیستم های بیان ژن برای تولید پروتئین های نو ترکیب…………………………… 53

2-1-16-2 – سیستم های باکتریایی……………………………………………………………………………… 54

3-1-16-2- سیستمpET………………………………………………………………………………………………… 54

4-1-16-2 –  سیستم مخمری و قارچی ……………………………………………………………………… 54

5-1-16-2 – حشرات …………………………………………………………………………………………………….. 55

6-1-16-2  – سلول پستانداران …………………………………………………………………………………….. 55

فصل سوم: مواد و روش کار

1-3- طراحی پرایمرها…………………………………………………………………………………………………………… 58

2- 3- تهیه تاكی‌زوئیت نئوسپورا کانینوم……………………………………………………………………………. 58

3- 3- استخراج DNA از تاكی‌زوئیتهای نئوسپورا کانینوم خالص شده……………………………. 59

۴- ۳- تکثیر قسمتی از ژن NcSAG1 با روش PCR………………………………………………………… 60

5- ۳- خالص سازی باند مورد نظر از ژل آگاروز ………………………………………………………………… 61

6- ۳- اتصال Ligation) ) محصول PCR در پلاسمید pTZ57R …………………………………….. 62

7-3- تهیه ی سلول های پذیرا Competent cells)) از باکتری  E.coli GM2163 ……….. 62

٨-٣- وارد کردن پلاسمید به درون سلول باکتری ( (Transformation……………………………. 63

9-3- تأیید وجود پلاسمید حاوی قطعه ی ژن مورد نظر درون کولونی باکتری …………….. 63

۱۰- ۳- تعیین توالی پلاسمیدهای بدست آمده (Sequencing)………………………………………. 64

۱۱- ۳- برش قطعات حاوی NcSAG1 و پلاسمید  pET-28a………………………………………… 66

۱-۱۱- ۳- برش NcSAG1 و پلاسمید  pET-28a

با آنزیم های NcoІ  و ІІІ Hind…………………………………………………………………………………… 67

عنوان                                                                                                                      صفحه

12- ۳- اتصال قطعات برش خورده ی NcSAG1 و پلاسمید  pET-28a(Ligation)…….. 67

-۱۳ ۳- تأئید وجود قطعه هدف NcSAG1)) درون پلاسمید  pET-28a………………………. 67

-۱۴ ۳- انتقال وكتورحاوی ژن موردنظر به داخل باكتری E.coli BL21 …………………………. 68

-۱۵ ۳- بررسی چند كولونی رشد كرده برای ارزیابی وجود ژن كلون شده……………………… 68

-۱۶ ۳- جداسازی پلاسمید SAG1-pET28 ……………………………………………………………………… 69

-۱۷ ۳- برش پلاسمید با آنزیمهای NcoІ و HindІІІ  و الكتروفورز محصول

برای اطمینان از وجود قطعه مورد نظر در پلاسمید  ……………………………………………………….. 69

-۱۸ ۳- انتخاب یك یا دو كلون برای توالی یابی (برای حصول اطمینان

از توالی درست ژن)…………………………………………………………………………………………………. 69

-۱۹ ۳- پس از حصول اطمینان از توالی ژن، كلون مورد نظر برای بیان ژن

مورد استفاده قرار می گیرد…………………………………………………………………………………….. 69

 

۲۰-۳- خالص سازی (Purification) پروتئین های تولیدشده به فرم گنجیدگی های

درون سلولی(Inclusion body) تحت شرایط دناتوره کننده…………………………………………….. 70

۲۱-۳- حل کردن (Solubilization)و بازتاخوردگی ( Refolding) پروتئین های

تولیدشده به فرم گنجیدگی های درون سلولی (Inclusion body)…………………………………… 71

۲۲- ۳- اندازه گیری غلظت پروتئین نوترکیب  NcSAG1به روش لوری………………………… 73

۲۳-۳- ارزیابی پروتئین نوتركیب خالص شده و بازتاخورده با استفاده از

SDS-PAGE  و وسترن بلاتینگ(Western Blotting)……………………………………………………… 74

۲۴- ۳- آزمایش وسترن بلاتینگ پروتئین ها……………………………………………………………………… 75

1-24- ۳-  بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………….. 75

2-24-3- مسدود سازی سطح کاغذ (Blocking)………………………………………………………… 75

3-24- ۳- اضافه کردن سرم ضد نئوسپورا……………………………………………………………………. 76

4-24- ۳- اضافه کردن آنتی بادی کنژوگه……………………………………………………………………. 76

5-24- ۳- اضافه کردن محلول سوبسترا………………………………………………………………………… 76

۲۵- ۳- پوشاندن (Coating) ذرات لاتكس با آنتی ژن نوتركیب NcSAG1……………………. 77

۲۶- ۳- جمع آوری نمونه های سرم……………………………………………………………………………………. 78

۲۷-۳- انجام تست لاتكس آگلوتیناسیون LAT) )…………………………………………………………….. 78

۲۸-۳- انجام تست الایزا……………………………………………………………………………………………………….. 79

۲۹-۳- مقایسه ارزش تشخیصی تست لاتكس آگلوتیناسیون LAT) )

بر اساس آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 با تست الایزا ………………………………………………………. 79

عنوان                                                                                                                      صفحه

فصل چهارم: نتایج

۱-۴- تکثیر قسمتی از ژن NcSAG1 با روش PCR…………………………………………………………. 81

۲-۴- کلون کردن ژن NcSAG1 در پلاسمید pTZ57R/T………………………………………………. 82

۳-۴- استخراج پلاسمید از کلون 2163 E.coli GM حاوی قطعه ژنی مورد نظر

در پلاسمید pTZ57R/T………………………………………………………………………………………………………… 83

۴-۴- برش پلاسمید حاوی قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a  (کلون 2821)

با آنزیم ІІІ Hind …………………………………………………………………………………………………………………. 84

۵-۴- برش قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a  بریده شده با آنزیم ІІІ Hind، بوسیله

یک مطلب دیگر :

آنزیم NcoІ……………………………………………………………………………………………………………………………. 85

۶-۴- خالص سازی قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a  بریده شده با آنزیم های

ІІІ Hind و NcoІ…………………………………………………………………………………………………………………. 86

۷-۴- کلون کردن قطعه ژنی NcSAG1 بریده شده در پلاسمید pET-28a

بریده شده با همان آنزیم ها………………………………………………………………………………………………… 87

۸-۴- نتایج بیان پروتئین نوتركیب………………………………………………………………………………………. 88

۹-۴- نتایج خالص سازی پروتئین نوترکیب تولیدشده به فرم

گنجیدگی های درون سلولی……………………………………………………………………………………………….. 91

۱۰-۴- نتایج اندازه گیری غلظت پروتئین نوترکیب NcSAG1 به روش لوری……………….. 93

۱۱-۴- نتایج حاصل از وسترن بلاتینگ پروتئین نوترکیب خالص شده

تحت شرایط دناتوره کننده…………………………………………………………………………………………………… 94

۱۲-۴- نتایج حاصل از الکتروفورز و وسترن بلاتینگ پروتئین نوترکیب بازتاخورده………… 95

۱۳-۴- نتایج حاصل از تست لاتكس آگلوتیناسیون……………………………………………………………. 95

فصل پنجم: بحث

پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………. 103

فهرست منابع و مآخذ……………………………………………………………………………….. 104

مقدمه

نئوسپورا کانینوم تك یاخته اجباری داخل سلولی از شاخه آپی کمپلکسا ، اولین بار توسط برکاس و همكارانش (۱٩۸۴) توصیف شد. دوبی و همكاران (۱٩۸۸) این تک یاخته را برای اولین بار از سگ ها جدا و نامگذاری كردند (Dubey et al. 1988a,b) سپس مشخص شد كه میزبان نهائی نئوسپورا کانینوم، سگ است (Holmdahl and Mattsson 1996; Lindsay et al. 1995  Basso et al. 2001;).

نئوسپورورزیس از علل اصلی سقط جنین گاو است، از این رو با سقط ‌، مرده زائی، تولدگوساله ضعیف یا همراه با عفونت دائمی و كاهش تولید شیر ضررهای اقتصادی قابل توجهی ایجاد می كند. انتشار عفونت در گاو با انتقال تاكی زوئیت از مادر به جنین و یا با خوردن آب و غذائی آلوده به اووسیست انگل صورت می گیرد 1999, Trees et al. 1999; Romero et al. 2004) Dubey).

مطالعات انجام شده در برخی كشورها حاكی از این است كه ۴۲-۱۳ درصد جنین های سقط شده در گاوها به این انگل آلوده هستند (Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006 ). نئوسپورا کانینوم علاوه بر گاو ، سایر گونه های اهلی چون اسب، گوسفند، بز، شتر، سگ، گربه و سگ سانان وحشی را آلوده می كند (Dubey 2003; Gondinm 2006 ).

نئوسپوروزیس انتشار جهانی داشته و از بسیاری از كشورهای جهان گزارش شده است، ایران نیز از این قائده مستثنی نیست. در بررسی آلودگی نئوسپورا کانینوم در گاوهای شیری سقط كرده، رزمی و همكاران (۲۰۰۶) اولین مورد سقط جنین گاوی را در مشهد گزارش كردند و ۱۸/۱۵درصد نمونه های سرمی گاوها در تست  IFAمثبت بودند

(et al. 2007; Sadrebazzaz et al. 2004  Razmi).

با توجه به گزارشاتی مبنی بر وجود آلودگی در گاوهای كشور و خسارات اقتصادی حاصله بر صنعت گاوداری، طراحی و ارزیابی تستهای تشخیصی حساس و اختصاصی كه توانایی تشخیص حیوانات آلوده را به منظور كنترل نئوسپورا کانینوم در سطح گله داشته باشند ضروری به نظر می رسد.

از زمان شناسایی نئوسپورا کانینوم تاكنون روشهای تشخیصی زیادی برای شناسایی آلودگی دامها به این انگل ابداع شده است. از این میان می توان به روشهای هیستوپاتولوژی، ایمونوهیستوشیمی، سرولوژی، مولكولی، كشت سلولی و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی اشاره نمو د

(2003 Dubey and Schares 2006 ; Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006; Dubey )

تشخیص قطعی بر اساس آزمایش ایمونوهیستوشیمی بافتهای آلوده است. این روش معمولاﹰ برای تأیید سایر روشها و نیز برای تفکیک نئوسپورا کانینوم از توکسوپلاسما گندئی استفاده شده اما روشی وقت گیر بوده و تفسیر نتایج آن مشکل است

(Dubey and Lindsay 1993; Jones 1996; Romand et al. 1998; Dubey and ;Schares 2006; Dubey 2003).

تشخیص آلودگی عمدتا با روشهای سرولوژیکی، به عنوان ابزار مهمی برای بررسی های کلینیکی و اپیدمیولوژیکی، انجام می شود (et al. 2007 Silva).

آزمایشات سرولوژیك دارای این مزیت هستند که قبل از مرگ دام قابل انجام بوده و اطلاعات کافی در مورد مرحله آلودگی فراهم می سازند (Dubey and Schares 2006). از آنجایی که تنها نشانه در معرض قرار گرفتن با نئوسپورا کانینوم، حضور آنتی بادی های اختصاصی در سرم گاو است، روشهای مختلف سرولوژیک برای تشخیص آنتی بادی به کار گرفته شده که شامل  IFAT، انواع الایزا وDAT هستند (et al. 1997 Williams  Romand et al. 1998;  Packham et al. 1998; Paré et al. 1995a;  Lally et al. 1996;  Conrad et al. 1993a;   Björkman and Lunden 1998; ). در این روشها از تاکی زوئیت کامل یا آنتی ژن های مشتق شده از تاکی زوئیت استفاده می شود که به علت واکنش متقاطع با سایر انگلهای مربوطه مانند توکسوپلاسما گندئی باعث واکنش مثبت کاذب می شود

(et al. 1993b; Dubey and Lindsay 1993 Conrad et al. 2003; ; 1999 Chahan Bjorkman and Uggla ). همچنین به علت نیاز این آزمایشات به استفاده از مقادیر زیاد آنتی ژنهای مشتق شده از کشت سلولی، اغلب تهیه آنتی ژن و استاندارد کردن آن مشکل است و به دلیل تفاوت در میزان بقایای سلول میزبان بر اختصاصیت و تکرارپذیری نتایج تست تاثیر می گذارد (Lally et al. 1996;  Jiang et al. 2008;  al. 1996;   et Baszler). بنابراین ضروری است که تست تشخیصی مطمئن، حساس و اختصاصی با استفاده از آنتی ژن های اختصاصی نئوسپورا کانینوم طراحی شود.

آنتی ژن های نوترکیب درمقایسه با آنتی ژن های کامل، مزایای بیشتری دارند زیرا اولا به آسانی درحجم زیاد تهیه می شوند و ثانیا به راحتی برای آزمایشات تشخیصی استاندارد می شوند. بنابراین با به كارگیری این آنتی ژن ها، نیازی به آنتی ژن های مشتق شده از کشت سلولی نیست (et al. 2003; Louie et al. 1997  Chahan).